作者：Fengyan Deng, Yan Wang, Luciana A. Castellano 和 Chongbei Zhao（通讯作者），均来自 Stowers Institute for Medical Research（斯托尔斯医学研究所）。 期刊：Cells，发表于 2026 年 9 月 24 日，文章编号 15, 1741。 文献类型：综述。
本综述系统梳理了从原代细胞（primary cells）到类器官（organoids）的体外细胞模型发展脉络，核心观点是：体外模型并不存在“越复杂越好”的线性优劣关系，而是应当依据具体科学问题和预期用途（context of use）来选择最合适的平台。文章主要讨论了原代细胞、永生化细胞系（immortalized cell lines）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）和三维类器官这四类主要模型，并在此基础上讨论了生物工程、标准化和人工智能等未来方向。
文章首先以历史发展为主线，回顾了体外细胞培养的关键里程碑。从 1665 年 Robert Hooke 首次观察细胞，到 1907 年 Ross Granville Harrison 利用悬滴法培养胚胎蛙组织并被认为是现代细胞培养的开端，再到 1951–1952 年 HeLa 细胞系的建立、1981 年小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）的成功分离、1998 年人胚胎干细胞的建立、2006 年 Yamanaka 团队利用四个转录因子将小鼠成纤维细胞重编程为 iPSCs，以及 2009 年 Clevers 实验室建立首个来源于 Lgr5 阳性肠道干细胞的类器官模型。这些节点共同勾勒出从简单二维培养走向三维组织模拟的技术演进路径。
在讨论原代细胞与永生化细胞系时，文章指出原代细胞的优势在于能够较好保留来源组织的转录组、蛋白质组和生理功能，因此在研究细胞生理、宿主—病原体相互作用、毒理学和药理学等方面具有较高生物学相关性。其局限则包括增殖能力有限、供体间变异大、细胞群体异质性强以及长期培养中容易发生表型漂移（phenotypic drift）。为克服复制性衰老（即 Hayflick 极限），永生化策略被广泛采用。常用的诱导永生化方法包括导入端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase, TERT）、猿猴病毒 40 大 T 抗原（SV40 large T antigen）、人乳头瘤病毒 E6/E7 蛋白以及细胞周期蛋白依赖性激酶 4（CDK4）等。文章特别强调，成功的永生化不仅仅是导入因子，而应当是一个从高质量原代细胞选择、培养条件优化、永生化策略确定、基因递送方法选择、克隆筛选与扩增，到最终鉴定的系统流程。其中，亲本细胞质量、组织消化条件、培养基成分、抗生素使用策略、细胞接种密度、氧气浓度等均会影响最终细胞系质量。在递送方法上，病毒载体（尤其是慢病毒载体）转导效率高但存在插入突变风险；非病毒方法如电穿孔、核转染和转座子系统安全性更好，但效率往往较低。克隆筛选不能只以增殖速度为标准，过快生长的克隆可能积累较多基因组异常。鉴定方面需要包括细胞身份确认、核型分析、永生化因子表达验证、功能学检测以及支原体污染检测。
关于 iPSC 技术，文章从胚胎干细胞的发展背景切入，指出尽管 ESCs 具有重要研究价值，但伦理问题和免疫排斥限制了其临床应用，这推动了诱导多能干细胞技术的出现。2006 年 Yamanaka 团队发现 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 四个转录因子（即 OSKM）足以将小鼠成纤维细胞重编程为 iPSCs，2007 年多个团队独立实现了人 iPSCs 的建立。在机制层面，重编程需要擦除体细胞的表观遗传记忆并重建多能性网络，其中间充质—上皮转化（mesenchymal-to-epithelial transition, MET）是成纤维细胞重编程中的关键步骤。重编程因子 OSKM 的作用机制各有侧重：Oct4 有助于建立多能性相关的染色质开放状态；Sox2 作为先驱因子（pioneer factor）能够结合闭合染色质并启动表观重塑；Klf4 促进增强子—启动子相互作用；c-Myc 则促进细胞周期和增殖。此外 Nanog 和 Lin28 可进一步提高重编程效率。在技术层面，递送方法分为整合型和非整合型两大类。整合型病毒载体效率高但存在插入突变和肿瘤发生风险；仙台病毒（Sendai virus）因仅在胞质中复制而不整合宿主基因组，被广泛用于临床级 iPSC 生产；附加体质粒（episomal plasmids）也被广泛应用；mRNA 递送和自复制 RNA（self-replicating RNA, srRNA）可在避免基因组整合的同时实现较高效率；蛋白递送和 miRNA 方法安全性好但效率较低；小分子化合物重编程则具有良好的可扩展性。重编程效率还受起始细胞类型、供体年龄、培养微环境、信号通路和表观遗传屏障等多重因素影响。例如，角质形成细胞和脐带血细胞的 reprogramming 效率通常高于成纤维细胞；低氧条件可提高重编程效率；TGF-β 信号是重编程的主要障碍之一，抑制该通路可促进 MET 并提高效率；Wnt/β-catenin 信号在重编程不同阶段发挥不同作用；维生素 C 和丙戊酸可分别通过促进 DNA 去甲基化和抑制组蛋白去乙酰化来增强重编程效率。p53 通路是重编程的重要障碍，激活的 p53 会诱导细胞周期停滞、凋亡和衰老，但抑制 p53 又可能导致基因组不稳定，因此在提高效率和维持基因组稳定性之间需要平衡。在 iPSC 鉴定方面，需要从形态学、多能性标志物（如 Oct4、Nanog、Sox2、SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81）、核型、三胚层分化能力等多个层面进行系统验证。
在类器官部分，文章首先明确了三维类器官的定义：来源于干细胞（包括 iPSCs 和成体组织驻留干细胞）、具有自组织和自我更新能力的三维培养物。与二维单层培养相比，类器官恢复了顶端—基底极性、细胞—细胞和细胞—基质相互作用以及生理性氧、营养和信号梯度，因此能更准确地反映体内组织结构和功能。从历史看，1907 年 Wilson 发现分离的海绵细胞可自发重聚并再生为完整个体，首次揭示了细胞的自组织特性；Steinberg 的差异黏附假说（differential adhesion hypothesis）进一步解释了细胞分选和空间排列的热力学原理；2009 年 Sato 等人建立的首个肠道类器官标志着现代类器官技术的诞生。此后，脑、肝、胰、肾、肺、视网膜、心、胃和子宫内膜等类器官模型相继建立。类器官的细胞来源包括多能干细胞和成体干细胞两大类。多能干细胞来源的类器官通过模拟胚胎发育中的信号通路，按步骤诱导胚层分化和组织形态发生；成体干细胞来源的类器官则依赖组织驻留干细胞在特定生态位因子（如 R-spondin、Noggin、Wnt 激动剂）支持下进行自组织。类器官的生成方式可分为支架依赖型、无支架型和生物工程型。支架依赖型常用 Matrigel 或合成细胞外基质，能较好地模拟天然基质但仍存在批次间差异和成分不明确的问题；无支架方式如悬滴法和微孔阵列聚集法可获得较高均一性，但缺乏基质信号支持；生物工程方法如 3D 生物打印和器官芯片（organ-on-a-chip）提供了更高的空间控制能力和动态流体环境，但技术复杂、成本较高。在类器官表征方面，需要使用共聚焦显微镜、光片荧光显微镜（light-sheet fluorescence microscopy, LSFM）和高通量开放式多孔光片平台等手段进行结构、细胞组成和功能的多层次验证。
文章最后讨论了体外模型的共同挑战，包括微生物污染（尤其是支原体污染）、遗传不稳定性、表型漂移、供体和批次间变异，以及缺乏完整的血管化、免疫成分、神经支配和系统代谢等微环境要素。文章认为，标准化、生物工程、自动化和人工智能将是推动高级细胞模型转化为稳健的新方法学（new approach methodologies, NAMs）并在生物医学研究和药物开发中实现转化应用的关键。综述的整体框架是“适合目的”（fit-for-purpose），即模型选择应由生物学问题和具体应用场景驱动，而不是简单地认为模型越复杂其生物学相关性就越好。