在BMC Medicine期刊上，由北京大学健康科学中心系统生物医学研究所的王欢教授（Huan Wang）及其团队领衔，联同哈佛医学院系统药理学实验室等机构的研究人员，于2023年发表了一项关于多种酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitors, TKIs）引发心脏毒性机制的重要研究。该研究旨在阐明临床上广泛使用但存在心脏副作用的多种TKIs导致心肌损伤的具体分子通路，以期为预防或治疗此类药物相关心脏并发症寻找潜在靶点。

近年来，TKIs作为靶向疗法已极大改善了多种癌症患者的预后。然而，随着用药时间的延长，其导致的心脏毒性问题日益凸显，如心力衰竭、心肌缺血、高血压等，严重影响了患者的生活质量乃至生存期。尽管此前研究表明TKIs的心脏毒性可能涉及“靶上效应”（on-target）和“靶外效应”（off-target），但其具体分子病理机制，尤其是心肌细胞在转录组层面如何响应不同TKIs，以及是否存在共通的、可干预的关键通路，尚不明确。本研究的核心目标正是通过系统性地对比八种具有不同心脏毒性等级的TKIs对人类心肌细胞的表型及转录组影响，揭示其调控心脏毒性的潜在分子机制，并聚焦于其中关键的细胞应激反应通路进行深入的机制验证。

本研究的工作流程系统而深入，主要包含以下几个核心环节： 第一环节，模型建立与初步毒性分级。 研究团队首先建立了一个基于人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, hiPSC-CMs）的体外模型。他们选取了八种TKIs：阿法替尼（Afatinib）、吉非替尼（Gefitinib）、克唑替尼（Crizotinib）、达沙替尼（Dasatinib）、尼洛替尼（Nilotinib）、索拉非尼（Sorafenib）、舒尼替尼（Sunitinib）和普纳替尼（Ponatinib），根据文献报告将其分为低、中、高三个心脏毒性等级。为了评估这些药物对心肌细胞的毒性效应，研究者设计并执行了一系列多剂量（0.32至10 µM）、多时间点（1至5天）的表型分析。他们测量了细胞ATP水平、利用微电极阵列记录了细胞的搏动速率、阻抗和细胞外场电位，并通过Seahorse分析仪检测了线粒体耗氧率。这些详尽的表型数据旨在从能量代谢、收缩功能和线粒体功能三个维度全面评估TKIs的即时和累积毒性。结果显示，大多数TKIs（如阿法替尼、克唑替尼、尼洛替尼、普纳替尼、舒尼替尼）引起了剂量和时间依赖性的ATP水平下降，而索拉非尼、普纳替尼和舒尼替尼显著抑制了线粒体最大呼吸能力。基于这些细胞实验数据以及从美国FDA不良事件报告系统（FAERS）中挖掘的患者数据，研究团队对八种TKIs的心脏毒性进行了排序，发现细胞模型的毒性排序与临床报道基本一致，验证了hiPSC-CMs作为研究心脏毒性细胞模型的可靠性。

第二环节，高通量转录组学分析与通路富集。 这是本研究的核心发现步骤。为了深入探究TKIs诱导心脏毒性的分子机制，研究者对经过不同TKIs处理（涵盖不同毒性水平、剂量和时间点）的hiPSC-CMs进行了大规模转录组测序。他们采用了一种名为“3’端数字基因表达结合唯一分子标识符（3’digital gene expression with unique molecular identifiers, 3’DGE-UMI）”的RNA测序方法，对总计129个样本（包括对照）进行了分析。这种方法利用UMI技术提高了定量的准确性。通过对转录组数据进行t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）聚类分析和主成分分析（PCA），研究人员发现了一个关键现象：不同TKIs引起的转录组变化主要是“药物特异性”的，而非“靶点特异性”或简单地由剂量/时间/毒性等级驱动。例如，靶向相同激酶（如EGFR）的阿法替尼和吉非替尼，其转录组特征被分在了不同的聚类中。值得注意的是，通过基因本体（GO）富集分析，他们发现在由阿法替尼、索拉非尼和高剂量普纳替尼处理样本主导的两个聚类（聚类3和聚类6）中，最显著富集的通路是“内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ER stress）”反应。这提示ER应激可能是这三种TKIs诱发心脏毒性的一个共同关键机制。

第三环节，内质网应激通路的验证与机制探索。 基于转录组学的发现，研究转入机制验证阶段。考虑到hiPSC-Cms成本高昂且培养周期长，后续实验主要使用新生大鼠心肌细胞（neonatal rat cardiac myocytes, NRCMs）进行，因其已被广泛用于心脏疾病机制研究且在本研究中显示出对相关TKIs的敏感性。研究人员首先在NRCMs中验证了阿法替尼、索拉非尼和普纳替尼确实能诱导ER应激。通过定量PCR和蛋白质印迹（Western Blot）检测，他们发现这三种药物均能显著上调ER应激的标志性基因，如ATF4、CHAC1、DDIT3（CHOP）、XBP1s、DNAJB9、HSPA5等，并快速激活ER应激上游关键蛋白PERK（表现为eIF2α磷酸化增加）和IRE1α（表现为XBP1s剪接体增加）。有趣的是，三种药物激活ER应激下游分支（PERK-eIF2α-ATF4轴和IRE1α-XBP1s轴）的程度和时序存在差异。 为了探究ER应激的上游诱因，研究者检测了活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）和脂质过氧化水平。结果显示，三种TKIs均在处理后3小时诱导了短暂的ROS升高，并在24小时导致显著的脂质过氧化。索拉非尼还引起了快速的胞质钙超载。然而，使用抗氧化剂Trolox虽然降低了脂质过氧化水平，却未能阻断ER应激基因的上调，甚至在某些情况下增强了其表达，暗示ER应激的调控可能还涉及除氧化应激以外的复杂因素。 为了在体内验证这一发现，研究团队建立了大鼠短期灌胃模型，分别给予普纳替尼（15 mg/kg）和索拉非尼（50 mg/kg）3天和7天。结果显示，普纳替尼处理7天后，大鼠心脏中IRE1α-XBP1s轴的下游基因DNAJB9表达显著上调，同时心脏胎儿基因ANP的表达也增加，表明普纳替尼在体内确实诱导了ER应激和早期心脏损伤标志。

第四环节，ER应激下游通路在心脏毒性中的作用解析。 这是本研究最具转化潜力的部分。ER应激可导致细胞凋亡或炎症等不同结局。为了明确在TKIs诱导的心脏毒性中，ER应激通过哪条下游通路发挥作用，研究者使用了通路选择性抑制剂：ISRIB（抑制PERK-eIF2α-ATF4轴）和4μ8c（抑制IRE1α-XBP1s轴）。他们将这些抑制剂与三种TKIs共同处理NRCMs，并检测了细胞活力、凋亡以及一系列与心脏损伤相关的基因表达。 关键发现如下：1) 抑制PERK或IRE1α通路均未显著改变阿法替尼或普纳替尼处理后的细胞活力，但4μ8c能部分挽救索拉非尼诱导的细胞死亡。2) 更重要的是，两种抑制剂（特别是4μ8c）能显著阻断由这三种TKIs诱导的心脏胎儿基因（如ANP、BNP）和促炎基因（如NFKB1、IL6、TNF、TXNIP、IL1B）的上调表达。这表明，TKIs通过协同激活PERK和IRE1α这两条ER应激下游通路，促进了心肌细胞中胎儿基因程序的重新表达和炎症反应，而这一过程而非直接的细胞凋亡，可能是它们导致心脏功能损伤的关键机制。

本研究的结论明确指出，阿法替尼、索拉非尼和普纳替尼通过诱导心肌细胞发生内质网应激，进而激活PERK和IRE1α信号轴，促进促炎因子和心脏胎儿基因的表达，从而导致心脏毒性。其中，ER应激诱导的炎症反应是缓解普纳替尼和索拉非尼所致心脏毒性的一个有前景的治疗靶点。这一发现为理解TKI相关心脏毒性的分子病理提供了全新的视角，并为开发心脏保护性辅助疗法（在不影响抗癌疗效的前提下）指明了潜在方向。

该研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先，研究设计系统且全面，首次在同一研究中大规模、多维度（剂量、时间、表型、转录组）对比了八种临床常用TKIs对心肌细胞的影响，超越了以往单药或固定条件的研究模式。其次，采用了先进的高通量转录组学技术（3’DGE-UMI RNA-seq）作为发现工具，成功地从海量数据中挖掘出ER应激这一之前未被充分认识的共同关键通路，体现了组学数据在机制探索中的强大驱动作用。第三，机制研究深入且具有逻辑性，从体外细胞模型到在体动物模型，从上游诱因（ROS、钙）探索到下游通路（PERK vs. IRE1α）的功能解析，层层递进，证据链完整。特别是明确了ER应激通过促进炎症而非主要依赖凋亡来介导心脏毒性，这一发现具有重要的理论和应用价值。最后，研究提出的“靶向ER应激下游特定通路以减轻心脏毒性”的策略，为新兴的肿瘤心脏病学（Cardio-Oncology）领域提供了新的治疗思路。当然，研究也存在一定局限性，如在体验证时间较短，未评估长期心功能；部分机制（如ER应激与线粒体功能障碍的交互作用）有待进一步探索；以及从大鼠模型到人体应用的转化仍需谨慎。但毋庸置疑，这项研究极大地丰富了我们对TKI药物心脏副作用的认识，其提供的数据集和 mechanistic insight 将为后续的基础研究与临床干预策略开发奠定坚实的基础。