本研究由杭州医学院药学院的刘晓彤、黄文康、易晓敏、龚浩康、张壮宁、陈佳慧、高丽娟以及浙江大学动物科学学院的张萌、孙红祥、叶益萍等人共同完成。通讯作者为孙红祥和叶益萍。该研究发表于 International Journal of Biological Macromolecules 第339卷，文章编号150039，于2025年12月31日在线发表。

本研究属于天然产物免疫药理学领域，聚焦于植物来源果胶多糖的免疫调节活性及其分子机制。常山胡柚（Citrus aurantium ‘Changshan-huyou’）是中国浙江常山地区栽培历史超过600年的柑橘类杂交品种，其未成熟果实入药称“衢枳壳”，传统上用于呼吸系统与胃肠道疾病的治疗。已有研究表明该植物的黄酮类、柠檬苦素类及挥发油成分具有抗炎、抗氧化等活性，但其所含多糖是否具有免疫调节功能尚不清楚。基于此，本研究首次从常山胡柚未成熟果实中分离纯化得到一种果胶多糖（CSHYP），系统评价了其在环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠及RAW264.7巨噬细胞中的免疫调节作用，并结合转录组学分析探讨其激活巨噬细胞的分子机制。

研究首先对CSHYP进行了提取、纯化和理化性质表征。以水提醇沉法结合AB-8大孔树脂柱层析、酶法与Sevage法联合脱蛋白、透析等步骤制备CSHYP，产率为3.35%。化学分析显示其总糖含量为93.96%，糖醛酸含量高达63.49%，蛋白质含量为5.23%。高效凝胶渗透色谱分析表明CSHYP主峰分子量为43,568 Da，占总多糖的96.99%，分散系数为1.008，提示其均一性良好。单糖组成分析显示其主要单糖为半乳糖醛酸（60.92 mol%）、半乳糖（19.94 mol%）、阿拉伯糖（14.53%）及少量鼠李糖（3.37%）。红外光谱证实了酯化糖醛酸及多糖特征官能团的存在。扫描电镜和原子力显微镜观察显示CSHYP呈片状或不规则颗粒形态，且分子链在溶剂中易发生聚集缠绕。

在体内免疫调节实验中，研究者采用环磷酰胺（CTX）诱导的免疫抑制BALB/c小鼠模型，设立正常对照组、模型组、CSHYP低中高剂量组（50、100、200 mg/kg）及阳性对照黄芪多糖组（50 mg/kg），每组5只，连续给药10天。结果显示，CTX处理显著降低小鼠脾脏指数及血清IgA、IgG、IgM水平，并抑制ConA和LPS刺激的脾淋巴细胞增殖；而CSHYP能够剂量依赖性地恢复上述免疫学指标，表明其可在整体动物水平上修复受损的免疫功能。

在体外细胞实验中，以小鼠RAW264.7巨噬细胞为模型，通过CCK-8法、FITC-dextran吞噬实验、ELISA、RT-qPCR、Griess法、流式细胞术等检测CSHYP对巨噬细胞活化的影响。结果表明，CSHYP在25–400 μg/ml浓度范围内无明显细胞毒性，且能显著促进RAW264.7细胞增殖。CSHYP剂量依赖性地增强巨噬细胞对FITC-dextran的吞噬能力；显著上调TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的mRNA表达并促进其蛋白分泌；同时诱导NO和细胞内活性氧（ROS）的产生。流式细胞术分析显示CSHYP显著上调细胞表面共刺激分子CD80、CD86（经典活化M1型标志）及CD206（替代活化M2型标志）的表达水平，表明其可同时诱导巨噬细胞向M1和M2双极化方向活化。

为阐明CSHYP激活巨噬细胞的分子机制，研究者对100 μg/ml CSHYP处理4、8、12、24 h的RAW264.7细胞进行了转录组测序（RNA-seq）。主成分分析显示CSHYP处理组与对照组转录谱存在显著差异。差异表达基因分析发现各时间点分别鉴定出273、227、246、281个差异基因，其中上调基因占绝对优势，提示CSHYP主要发挥免疫刺激功能。通过四组差异基因的韦恩图分析，共获得128个在所有时间点持续差异表达的基因，其中125个上调、3个下调。GO功能富集分析显示这些持续差异基因主要富集于抗病毒天然免疫应答、I型干扰素应答、细胞因子活性、细胞因子受体结合等生物学过程与分子功能。KEGG通路富集分析结果表明这些基因显著富集于TNF信号通路、NF-κB信号通路、NLR信号通路、TLR信号通路、RLR信号通路及胞质DNA传感通路等天然免疫关键信号途径。进一步通过STRING数据库构建蛋白互作网络，利用Cytoscape的MCODE和CytoHubba插件筛选出13个核心枢纽基因，包括TNF、IL6、IL1B、CXCL10、CCL2、CSF2、CCL5、SOCS3、CSF3、IL1A、CCL4、CD40和IRF7。

基于转录组学分析结果，研究者采用Western blot和ELISA对TLR4-NF-κB及TLR4-IRF7信号轴进行了实验验证。结果显示CSHYP可显著上调RAW264.7细胞中TLR4蛋白的表达，促进IκBα、NF-κB p65及IRF7的磷酸化，并诱导IFN-β的分泌。利用TLR4特异性抑制剂TAK-242预处理细胞后发现，TAK-242能够显著逆转CSHYP诱导的NF-κB p65和IRF7磷酸化，同时抑制TNF-α分泌和NO产生。上述结果证实CSHYP通过TLR4介导的NF-κB和IRF7信号轴激活巨噬细胞。

本研究首次从常山胡柚未成熟果实中分离表征了一种富含半乳糖醛酸的果胶多糖CSHYP，证实其能够在体内恢复CTX诱导的免疫抑制小鼠的免疫功能，并在体外通过增强吞噬活性、促进NO、ROS及多种细胞因子产生、上调共刺激分子表达等途径激活RAW264.7巨噬细胞。机制研究表明CSHYP通过TLR4介导的NF-κB和IRF7信号通路发挥巨噬细胞活化作用。该研究为常山胡柚多糖作为新型天然免疫调节剂的开发利用提供了科学依据，也为果胶类多糖的免疫药理学研究提供了新的实验范式。

本研究的亮点在于：首次揭示常山胡柚未成熟果实果胶多糖的免疫调节活性；采用转录组学与实验验证相结合的策略，系统描绘了CSHYP激活巨噬细胞的分子网络；发现CSHYP可同时诱导M1和M2型巨噬细胞活化标志，提示其具有双向免疫调节潜力。此外，研究指出由于当前CSHYP纯度有限，其结构特征与免疫活性之间的构效关系尚未完全阐明，未来需进一步纯化并深入解析其结构-活性关联，以推动果胶类免疫调节剂的理性设计与优化。