本研究由周宇、韩丹、张凯等为主要作者，来自第二军医大学东方肝胆外科医院胆道外科、第二军医大学药学院以及上海理工大学健康科学与工程学院。通讯作者为赵庆杰、邹燕和尹磊。论文发表于Bioorganic Chemistry期刊，2025年5月9日在线发表，收录于该刊第161卷，文章编号108561。
该研究属于抗肿瘤药物研发领域，聚焦于从天然抗菌肽中开发新型抗癌候选分子。抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）是生物体天然产生的具有广谱抗菌活性的多肽，近年研究发现部分抗菌肽对肿瘤细胞也具有显著杀伤作用。Smp43是从埃及蝎子Scorpio maurus palmatus毒液中分离得到的由43个氨基酸组成的天然抗菌肽，分子量约4653 Da，对肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病和直肠癌等多种癌细胞均表现出抑制增殖和诱导凋亡的活性。然而，smp43分子较大且线性肽在体内稳定性差、膜通透性不足，限制了其直接成药的可能性。此前已有研究通过截短发现smp(1-14)这一来自smp43 N端的14个氨基酸片段具有优于母肽的抗菌活性，并能在膜环境中形成α-螺旋，通过在细菌质膜上形成孔道杀伤细菌。受此启发，本研究的目标是明确smp43中负责抗癌活性的关键片段，并采用钉合肽（stapled peptide）策略对关键片段进行结构优化，以提高其抗肿瘤活性、稳定性和细胞膜通透性，最终获得具有开发前景的抗癌先导肽。
研究首先对smp43进行截短，合成了覆盖全序列的多个14氨基酸线性片段，通过CCK-8法检测这些片段对HepG2肝癌细胞的细胞毒性，发现smp(1-14)在100 μM浓度下表现出明显强于其他片段的抑制活性，且与全长smp43相当。为进一步验证关键片段，研究者将smp43分为smp(1-22)和smp(22-43)两个片段并进行梯度浓度实验，结果显示smp(1-14)在所有线性肽中对HepG2细胞的抑制作用最强，并呈浓度依赖性；smp(1-22)在100 μM时活性较smp(1-14)下降近4倍，而smp(22-43)几乎完全丧失细胞毒性。因此确定smp(1-14)为关键抗癌片段。
接下来，研究者对smp(1-14)进行钉合修饰。钉合策略通过在多肽i和i+4位置引入非天然氨基酸S5，并利用Grubbs第一代催化剂进行关环复分解反应（ring-closing metathesis, RCM），限制α-螺旋构象，从而提高肽的稳定性、膜通透性和靶蛋白结合能力。研究共合成6个钉合肽，分别命名为ssmp1至ssmp6，钉合位置分别位于W3/K7、D4/K8、W5/T9、I6/A10、K7/G11和T9/I13。所有钉合肽经半制备高效液相色谱纯化至95%以上纯度，并通过高分辨质谱确认结构。
随后，研究者对钉合肽的抗癌活性进行系统评价。CCK-8实验显示，在100 μM浓度下，钉合于C端的ssmp6对HepG2和Huh7细胞的毒性均强于线性肽smp(1-14)；ssmp1和ssmp4对Huh7细胞活性也较强，但ssmp4对HepG2的毒性较smp(1-14)下降约三倍；ssmp3活性与smp(1-14)相当；而ssmp2和ssmp5活性降低，提示D4、K7、K8和G11这些氨基酸残基对抗肿瘤活性具有重要作用。圆二色谱分析表明，ssmp2螺旋度最低（34.53%），ssmp5螺旋度最高（61.42%），说明适度的螺旋度有利于活性发挥。进一步的量效关系研究显示，ssmp1、ssmp3和ssmp6在25 μM起即表现出远高于smp(1-14)的细胞毒性，其中ssmp6呈浓度依赖性抑制HepG2和Huh7细胞生长。IC50测定结果显示，ssmp6对HepG2和Huh7的IC50分别为23.07 μM和12.10 μM，分别是smp(1-14)的约1/2和1/6（smp(1-14)对应IC50为50.89 μM和74.40 μM），表明C端钉合可显著增强线性肽的抗肿瘤活性。此外，研究还尝试在ssmp6 N端引入硬脂酸修饰，生成ssmp6-s，但该修饰反而导致对两种肝癌细胞的毒性大幅降低，说明脂肪酸修饰在该结构背景下不利于活性保持。
在机制研究中，研究者首先通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。结果显示ssmp6诱导HepG2细胞凋亡的比例呈浓度和时间依赖性升高，且10 μM的ssmp6诱导的凋亡比例与40 μM的smp(1-14)在各时间点相当，说明钉合后肽的促凋亡能力显著增强。Western blot分析信号通路发现，ssmp6剂量依赖性地降低Akt磷酸化水平，同时提高MAPK通路中ERK的磷酸化水平，这与先前报道的smp43作用机制一致，即通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路并激活Ras/MEK/ERK通路诱导自噬。进一步使用凋亡抑制剂z-VAD-fmk和坏死性凋亡抑制剂nec-1进行干预实验，发现nec-1/ssmp6处理组中RIPK1磷酸化水平未较ssmp6单独处理组下降，而cleaved-caspase-3表达在nec-1/ssmp6组中较ssmp6组降低，表明ssmp6主要通过凋亡信号通路而非坏死性凋亡通路诱导细胞死亡。扫描电子显微镜观察显示，随着ssmp6浓度升高，HepG2细胞膜表面逐渐变得粗糙，完整细胞膜结构消失，证实ssmp6可直接破坏癌细胞膜完整性。
在细胞膜穿透性评价中，研究者将FITC标记的ssmp6和smp(1-14)分别与HepG2细胞孵育1小时，荧光显微镜观察和流式细胞术定量分析均显示，钉合肽FITC-ssmp6的胞内荧光强度显著高于线性肽FITC-smp(1-14)。在2.5 μM最低浓度下，FITC-smp(1-14)处理的细胞荧光阳性率为24.15%，而FITC-ssmp6达到91.41%，证明钉合策略可有效提高肽的细胞膜穿透能力，且这一结果与其破坏细胞膜的能力一致。
稳定性研究部分，研究者将ssmp6和smp(1-14)分别置于10%人血清中孵育不同时间，HPLC定量分析显示，线性肽smp(1-14)在3小时后降解约50%，24小时后仅剩余约23.45%；而钉合肽ssmp6在24小时后仍保留70%以上，表现出显著的抗血清降解能力。在糜蛋白酶稳定性实验中，smp(1-14)在30分钟内完全降解，而ssmp6在30分钟时仍保留27%。在大鼠肝微粒体代谢实验中，smp(1-14)的半衰期为33.0分钟，清除率为42.0 μL/min/mg；而ssmp6在1小时内未检测到代谢和清除，说明其代谢稳定性极佳。圆二色谱分析显示，在50%乙腈环境中，除ssmp2外，各钉合肽的α-螺旋度均高于smp(1-14)，其中ssmp6螺旋度为58.01%，与其高细胞毒性一致，进一步证明钉合策略可提高肽的螺旋度和结构稳定性。
本研究确定smp(1-14)为smp43的关键抗癌片段，通过C端钉合策略成功开发出先导肽ssmp6。与线性肽相比，ssmp6在抗肝癌细胞增殖、诱导凋亡、膜穿透性、血清稳定性、酶解稳定性和代谢稳定性方面均表现优异，并能下调Akt磷酸化、破坏癌细胞膜。该研究为基于抗菌肽开发新型抗肿瘤药物提供了重要候选分子和结构优化思路，证明了钉合修饰可有效提升线性抗癌肽的性能。研究的亮点在于：首次系统截短smp43并明确关键抗癌片段；将钉合策略应用于抗菌肽来源的抗癌肽优化；ssmp6在多个维度上均优于母体线性肽，显示出作为先导化合物进一步开发的价值。不过，ssmp6的体内抗肿瘤活性、靶向特异性和药代动力学性质仍需进一步改善，未来研究将聚焦于降低毒性和提高生物利用度，以推动其向临床应用转化。