第一部分：研究背景与概述
这篇文章由Sikai Ling, Shiqi Yang等研究人员撰写，隶属于上海交通大学、复旦大学、中国科学院以及丹麦奥胡斯大学的多个实验室与机构。该研究发表于《Nature Biomedical Engineering》2021年2月，主要讨论了一种基于携带mRNA的慢病毒粒子（mlp-crispr）技术，用于视网膜内血管疾病基因治疗（例如湿性年龄相关性黄斑变性，wet AMD）。研究的背景在于，CRISPR作为一种强大的基因编辑工具，具有治疗遗传性疾病、获得性疾病及传染病的潜力。然而，其具体应用仍面临关键挑战，特别是在核酸酶和引导RNA（gRNA）的高效且精准递送方面，而常用的病毒载体（如腺相关病毒，AAV），存在潜在的免疫反应及安全隐患。此外，针对湿性AMD当前的治疗手段（如抗VEGF药物）需要频繁注射，费用高且容易诱发副作用。因此，该研究旨在开发一种转瞬表达的CRISPR递送系统，通过在小鼠模型中验证其治疗湿性黄斑变性的效果。
第二部分：研究流程
为了实现高效且精准的基因递送，研究步骤分为以下几个环节：
研发慢病毒载体用于mRNA递送（Construction of MLP System）：
研究团队通过对HIV-1病毒基因组结构的改造，设计了一种能够携带外源mRNA的慢病毒载体。他们利用了HIV-1中psi信号与核衣壳蛋白的天然相互作用机制，同时引入了来源于噬菌体的MS2结合蛋白（MS2 coat protein, MS2C）及其识别干扰结构。通过优化慢病毒gag-pol核心蛋白对外源mRNA的结合能力，最终确定了效率最佳的病毒改构版本（ms2m-gag-pol）。
优化递送效率与载体性能：
在包括HEK293T细胞在内的多类细胞实验中测试了该系统的载体效率，包括对不同拷贝数stem-loop的影响以及与常规慢病毒的对比。实验发现，新的慢病毒递送系统不仅具有更高的递送效率，同时减少了额外表达的核酸酶Cas9蛋白（降低潜在的脱靶风险）。
开发整合mRNA和gRNA的全合一系统（All-in-One MLP-CRISPR System）：
团队进一步设计了一个“全合一”病毒载体系统，将编码Cas9的mRNA和靶向VEGFA的gRNA在同一颗粒中协同表达，并验证了其RNA封装的效率及编辑能力。在所有设计中，优化版的全合一载体表现了最佳编辑效率。
体内实验研究：
在小鼠中，通过检测慢病毒MLP-CRISPR递送系统的荧光分布，验证其在眼内视网膜色素上皮（RPE）细胞的高度特异性表达。此外，通过深度测序分析靶向编辑率和脱靶效应，证明该技术在小鼠中具有较高的准确性和靶向性。相比经典的AAV方法，MLP-CRISPR能够避免长期酶表达及随后的免疫反应。
动物模型有效性验证：
研究小组在激光诱导的小鼠湿性AMD模型中测试了靶向VEGFA基因敲除的治疗效果。他们通过单次视网膜下注射，观察到该递送系统能够在多达44%的RPE细胞中成功敲除VEGFA基因，并减少63%的脉络膜新生血管化（CNV）的病变面积。更重要的是，实验数据未检测到显著的脱靶突变或免疫反应。
第三部分：主要实验结果
1. 构建与评估：
MLP系统能够有效递送GFP mRNA，其效率远超传统慢病毒系统，同时提供了瞬时表达的CRISPR蛋白成分，并显著降低了表达强度，减少了Cas9的长期脱靶风险。
特异性与靶向性：
通过共荧光定量与qPCR验证，MLP-CRISPR在小鼠组织中的靶向性主要局限于RPE细胞，而未扩散至肝脏、脾脏等身体其他部位。
深度测序：
在小鼠RPE细胞的目标基因（VEGFA）编辑频率达到44%，未检测到重要的在预测脱靶位点上的突变。
动物模型疗效验证：
VEGFA基因的敲除与CNV病变面积减少具明确对应关系，显示MLP-CRISPR具备较高的治疗潜力。
第四部分：研究意义与应用
这项研究的主要意义在于开发了一种新型的基因编辑递送技术，克服了传统AAV系统导致的长期酶表达及免疫反应问题。特别是在治疗湿性AMD方面，MLP-CRISPR提供了一种潜在的“一次性”治愈方案，有望替代现有的抗VEGF药物疗法，大幅度减少患者的疗程次数。
此外，该技术可扩展用于其他眼科疾病及需限制脱靶效应的治疗领域。同时，技术平台也为后续递送碱基编辑器（Base Editor）、表观基因组编辑器（Epigenome Editor）提供了可能性。
第五部分：研究亮点与创新
1. 瞬时表达的新型递送系统：
相比传统递送技术，MLP系统的瞬时表达特性在安全性和精准度方面具有显著优势。
靶组织特异性强：
该载体在视网膜色素上皮的高特异性表达为提高治疗安全性提供了保证。
成功的体内验证：
单次注射治疗湿性AMD的疗效显示了这一系统在临床中长期发展的潜力。
总结：
通过慢病毒载体递送mRNA的前沿设计，结合精确的CRISPR基因编辑技术，本研究树立了新一代基因治疗的标杆。通过克服传统病毒系统的局限性，MLP技术具有广泛应用的潜能，包括罕见遗传病、眼科疾病及其他因基因突变引起的疾病治疗。