人类视网膜类器官揭示糖尿病视网膜病变的细胞与分子机制
作者及机构
本研究由捷克马萨里克大学（Masaryk University）医学院组织学与胚胎学系的Lada Polešovská、Tomáš Bárta等团队主导，合作机构包括布尔诺大学医院眼科、英国贝尔法斯特女王大学Wellcome-Wolfson实验医学研究所。研究成果发表于2025年《Cell Death and Disease》期刊（DOI: 10.1038/s41419-025-08244-1）。
学术背景
糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy, DR）是全球视力损伤的主要病因，由慢性高血糖及其代谢级联反应引发。传统观点认为DR是视网膜微血管病变，但近年研究发现神经退行性变化可能早于血管病变。然而，现有动物模型难以完全模拟人类视网膜病理特征，尤其是神经退行性环节。此外，妊娠期糖尿病对胎儿视网膜发育的影响缺乏合适研究模型。
本研究利用人类视网膜类器官（human retinal organoids），模拟渐进性高血糖应激（从基础培养的17.5 mM葡萄糖增至25 mM），旨在揭示不同分化阶段视网膜细胞对高血糖的响应机制，特别是光感受器（photoreceptor）的脆弱性及其分子通路。
研究流程与方法
1. 视网膜类器官分化与高血糖处理
- 细胞来源：使用健康供体皮肤成纤维细胞衍生的诱导多能干细胞（iPSCs）系N5和M8。
- 分化流程：
- 早期阶段（d30）：在无生长因子的化学限定培养基（GFCDM）中诱导神经视网膜前体细胞，添加BMP4促进视网膜命运定向。
- 晚期阶段（d90-d150）：转换为神经视网膜培养基（NR medium），含视黄酸和牛磺酸以促进光感受器成熟。
- 高血糖处理：在分化第30、90、150天时，分别将类器官暴露于25 mM D-葡萄糖（实验组）、17.5 mM D-葡萄糖（对照组）或L-葡萄糖（渗透压对照组）28天。
2. 实验分析
- 形态与基因表达：通过RT-qPCR检测视网膜发育标志物（如RAX、VSX2）、光感受器特异性基因（如OPN1SW、Rhodopsin）及凋亡相关基因（BAX、BIM）。
- 氧化应激检测：使用CellROX™ Green试剂标记活性氧（ROS），并通过免疫荧光定量。
- 转录组分析：RNA测序（NGS）比较对照组与高血糖组的差异表达基因，结合公共数据库（GSE160306）验证通路重叠性。
- 细胞凋亡与胶质活化：通过蛋白阵列检测凋亡标志物，免疫荧光染色观察cleaved caspase-3阳性细胞及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达。
3. 数据统计
采用R语言进行差异基因分析（DESeq2）、基因本体（GO）富集分析，并通过ANOVA比较各组间显著性差异。
主要结果
1. 早期类器官对高血糖的耐受性
- 形态与基因稳定性：d30和d90类器官在高血糖条件下未出现结构异常，视网膜前体细胞标志物（RAX、PAX6）表达无显著变化。
- 凋亡抵抗：早期类器官中凋亡基因（BAX、PUMA）未上调，表明高血糖未触发细胞死亡。
2. 晚期光感受器的特异性损伤
- 基因下调：d150类器官中，光感受器外节（outer segment, OS）相关基因（OPN1SW、Rhodopsin、S-antigen）表达显著降低，而转录因子CRX未受影响，提示高血糖选择性破坏功能成熟而非细胞命运决定。
- 氧化应激与凋亡：ROS水平在光感受器层显著升高（p<0.01），cleaved caspase-3阳性细胞集中于外核层（ONL），证实光感受器是高血糖主要靶点。
- 胶质细胞活化：星形胶质细胞标志物（GFAP、S100β）表达增加，提示高血糖诱导的神经炎症反应。
3. 转录组学揭示核心通路
- 差异基因：251个基因显著差异表达（p<0.05），富集于G蛋白偶联受体信号（GPCR）、光刺激响应、视觉感知等通路。
- 跨数据集验证：与人类DR视网膜数据（GSE160306）对比，50个基因重叠，涉及胶质生成（gliogenesis）和氧化应激反应。
结论与价值
- 科学意义：首次在人类视网膜类器官中证实，渐进性高血糖优先损伤光感受器，而双极细胞、神经节细胞等表现出较强耐受性。这一发现支持DR的“神经退行性先行”假说。
- 模型优势：类器官克服了动物模型与人类视网膜的物种差异，为妊娠期糖尿病或血糖控制不佳导致的视网膜损伤提供了人源化研究平台。
- 临床启示：光感受器氧化应激和胶质活化可能是早期干预靶点，为抗氧化或神经保护疗法提供理论依据。
研究亮点
- 创新方法：采用增量高血糖应激模型（17.5→25 mM），更贴近临床中血糖缓慢升高的病理过程，优于既往极端高糖（≥33 mM）研究。
- 技术整合：结合单细胞转录组、蛋白阵列和活细胞氧化应激成像，多维度解析DR机制。
- 转化潜力：模型可用于筛选保护光感受器的药物，或评估妊娠期高血糖对胎儿视网膜发育的影响。
局限性与展望
本研究未涵盖血管病变（因类器官无血管化），未来需开发血管化类器官或血-视网膜屏障模型以模拟DR全貌。数据已公开于GEO（GSE290024），供进一步挖掘。