金丝桃苷通过靶向cGAS抑制DNA诱导的小胶质细胞激活从而缓解光感受器退化
本研究由上海中医药大学岳阳中西医结合医院、上海市中医药研究院临床药理研究所的李代金、常杰、王玉珏、杜晓烨、徐静、崔金刚、张腾和陈宇*团队完成，发表于Acta Neuropathologica Communications期刊2024年第12卷第76期。
研究背景与目的
视网膜光感受器退化是年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性等疾病的共同病理特征，目前仍缺乏有效治疗手段。近年研究发现，神经炎症反应是光感受器退化疾病进展的关键因素，其中小胶质细胞（microglia）的异常激活在驱动神经炎症中发挥核心作用。因此，调控小胶质细胞的促炎激活成为治疗新策略。
金丝桃苷（hyperoside）是一种天然黄酮醇苷，具有抗氧化和抗炎活性。团队前期研究发现，在光损伤前给予金丝桃苷可预防光氧化应激诱导的光感受器退化（Li et al., 2023）。然而，金丝桃苷是否能够通过直接影响小胶质细胞介导的神经炎症来缓解光感受器退化尚不明确。本研究旨在： 1. 验证金丝桃苷对小胶质细胞促炎激活的抑制作用 2. 评估其在光损伤后对神经炎症和光感受器退化的治疗效果 3. 探究其作用机制是否涉及DNA感受器cGAS（cyclic GMP-AMP synthase）通路
研究方法与流程
1. 体外实验体系建立
- 细胞模型：使用BV-2小胶质细胞系（中国科学院细胞库）
- 刺激方案：
- LPS（脂多糖）刺激：20 ng/ml处理12-24小时
- ctDNA（小牛胸腺DNA）刺激：1 μg/ml处理3-6小时
- 药物处理：金丝桃苷（纯度≥98%）在刺激前1小时加入（剂量梯度：12.5-50 μM）
- 检测指标：
- ELISA检测TNF-α、IL-6、CCL2、IFN-β等炎症因子
- 划痕实验评估细胞迁移能力（Incucyte系统动态监测24小时）
- Western blot检测cGAS、p-TBK1等蛋白表达
- qPCR分析炎症相关基因表达
2. 动物实验设计
- 动物模型：6-12周龄雌性BALB/c小鼠（上海实验动物中心）
- 光损伤诱导：暗适应后暴露于10,000 lux白光30分钟
- 给药方案：
- 金丝桃苷组：光损伤后3小时开始腹腔注射（100 mg/kg，每日2次，持续7天）
- 阳性对照：2-APB（IP3受体拮抗剂，10 mg/kg）
- 阴性对照：溶媒处理
- 评估方法：
- 结构评估：光学相干断层扫描（OCT）测量外核层（ONL）厚度；HE染色组织学分析
- 功能评估：视网膜电图（ERG）记录a波和b波振幅
- 炎症评估：qPCR检测视网膜炎症因子表达；免疫组化观察IBA-1/CD68阳性小胶质细胞
- DNA释放检测：Evans blue染色观察细胞外DNA；dsDNA免疫荧光定位
3. 机制研究
- 分子对接：AutoDock Vina软件模拟金丝桃苷与小鼠cGAS（PDB ID:4O6A）的结合
- 表面等离子共振（SPR）：Biacore T200系统测定金丝桃苷与人cGAS的结合动力学
- 细胞热位移分析（CETSA）：验证金丝桃苷与cGAS的细胞内结合
- 无细胞酶活实验：Cayman化学试剂盒检测cGAS催化2’3’-cGAMP生成的抑制率
主要研究结果
1. 金丝桃苷抑制小胶质细胞活化
- 在LPS刺激的BV-2细胞中，金丝桃苷剂量依赖性地降低TNF-α（下降62.3%）、IL-6（下降57.8%）和CCL2（下降54.2%）的分泌（p<0.001）
- 划痕实验显示，50 μM金丝桃苷使LPS诱导的细胞迁移率降低41.5%（p<0.01）
- 在ctDNA刺激模型中，金丝桃苷同样显著抑制TNF-α、IL-6和IFN-β的产生（p<0.01）
2. 光损伤后治疗保护视网膜
- 结构保护：OCT显示金丝桃苷组ONL厚度比溶媒组增加28.7%（p<0.01），而2-APB组无显著改善
- 功能维持：ERG检测显示金丝桃苷组a波振幅提高2.3倍（3.1 log cd·s·m-2刺激下，p<0.01）
- 炎症抑制：qPCR显示视网膜中CCL5、CXCL10等炎症因子mRNA水平降低3-5倍（p<0.001）
- 小胶质细胞活化减少：免疫组化显示IBA-1+细胞在ONL的浸润减少72.4%（p<0.001）
3. DNA-cGAS通路调控机制
- DNA释放证据：
- 光损伤后3小时即观察到ONL区dsDNA核信号减弱（下降68.9%，p<0.001）
- Evans blue染色显示细胞外DNA积累（面积增加4.2倍，p<0.01）
- 通路抑制：
- 金丝桃苷使ctDNA刺激的BV-2细胞中2’3’-cGAMP水平降低59.3%（p<0.01）
- Western blot显示p-TBK1表达下降51.7%（p<0.01）
- 直接靶点验证：
- 分子对接显示金丝桃苷与cGAS结合能-9.01 kcal/mol，形成4个氢键（Ser420、Cys419等）
- SPR测定KD值为25.48 μM，表明中等强度结合
- CETSA证实金丝桃苷可提高cGAS热稳定性（48-57℃）
- 无细胞实验显示金丝桃苷抑制cGAS酶活（IC50≈32.5 μM）
研究结论与价值
本研究首次揭示： 1. 治疗策略创新：突破传统抗氧化思路，证实光损伤后金丝桃苷通过抗炎途径仍能有效缓解光感受器退化 2. 机制突破：发现cGAS是金丝桃苷的直接作用靶点，阐明其通过抑制DNA-cGAS-STING通路调控小胶质细胞活化的新机制 3. 转化意义：为视网膜退行性疾病提供双重作用靶点（氧化应激+神经炎症）的治疗方案
研究亮点
- 时序治疗设计：创新性采用”光损伤后给药”方案，排除直接抗氧化作用的干扰，专注验证抗炎效果
- 多维度验证：从分子（SPR/CETSA）、细胞（BV-2模型）、组织（视网膜切片）到功能（ERG）的完整证据链
- 技术整合：结合分子动力学模拟（50 ns）、自动化活细胞成像（Incucyte）等先进技术
- 临床相关性：所用金丝桃苷剂量（100 mg/kg）相当于人体等效剂量~8 mg/kg，在已知安全范围内
补充价值
研究还发现： - 坏死 photoreceptors 释放的自身DNA作为DAMPs（damage-associated molecular patterns）是神经炎症的早期触发因素 - 金丝桃苷对STING下游激活（如DMXAA刺激）无直接影响，体现其靶向特异性 - 为其他神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）中cGAS抑制剂的开发提供参考
该工作得到国家自然科学基金（82274264）支持，动物实验通过上海中医药大学伦理审查（YYLAC-2023-199-1）。