本研究题为《microneedle-facilitated portulaca oleracea l.-derived nanovesicles ameliorate atopic dermatitis by modulating macrophage m1/m2 polarization and inhibiting nf-κb and sting signaling pathways》，由Meng Long、Jiaqi Li、Yuecheng Zhu、Hang Ruan、Jing Li、Fanjun Xu、Ruipeng Liu、Tao Yang*、Yanqin Shi*、Nianping Feng*和Yongtai Zhang*等作者共同完成。作者单位包括上海中医药大学附属第七人民医院实验动物中心与服务部、上海中医药大学中药学院以及东方美谷集团美妆（上海）科技有限公司-东方美谷活性植物材料研究中心。该研究于2025年5月9日在线发表于学术期刊《Acta Pharmaceutica Sinica B》（影响因子2023：14.5），属于药剂学、皮肤病学和免疫学交叉领域的前沿探索。

该研究的学术背景聚焦于特应性皮炎（atopic dermatitis, AD）这一慢性、复发性、炎症性皮肤病。AD的临床管理面临易复发、副作用和高成本等多重挑战。目前主流疗法如外用糖皮质激素、生物制剂等存在疗效不稳定和不良反应等局限。近年来，植物来源的纳米囊泡（plant-derived nanovesicles，或外泌体，exosomes）因其携带生物活性物质（如蛋白质、核酸）并具有免疫调节和抗炎功能而成为研究热点。马齿苋（Portulaca oleracea L.）在中医临床中常用于外用治疗皮肤炎症，其提取物已被证实具有抗炎效果。本研究团队前期发现马齿苋来源的纳米囊泡（PDNV）在结肠炎模型中能有效抑制促炎细胞因子，展现抗炎潜力。然而，PDNV由于粒径较大（50-1000 nm），难以有效穿透皮肤角质层屏障，限制了其局部治疗AD的应用。同时，微针（microneedles, MNs）技术作为一种微创、安全、高效的透皮给药平台，为增强大分子或纳米制剂的皮肤递送提供了新思路。可溶性微针通常以透明质酸（hyaluronic acid, HA）为主要材料，但其高吸湿性可能导致穿刺过程中软化，影响递送效率和准确性。将具有免疫调节功能的马齿苋多糖（POP）与HA结合，有望改善微针的机械性能。基于此，本研究旨在：1) 深入表征PDNV的生物学特性和mRNA组成；2) 开发一种集成了HA、POP和PDNV的新型可溶性微针（POP-MNs-PDNV），以增强PDNV的皮肤渗透；3) 在细胞和动物模型中全面评估POP-MNs-PDNV治疗AD的疗效，并探究其通过调节巨噬细胞极化及相关信号通路（NF-κB, STING）发挥作用的潜在分子机制。

研究的详细工作流程可概括为以下几个关键步骤：首先，研究团队从新鲜马齿苋汁液中通过差速离心法提取并表征了PDNV。具体流程包括低速离心去除纤维和大颗粒，中速离心去除细胞碎片和完整细胞器，最后高速离心（150,000×g, 1.5 h）获得PDNV。表征手段包括透射电镜（TEM）观察形态，纳米粒径电位仪分析粒径和Zeta电位，纳米颗粒跟踪分析（NTA）计数，SDS-PAGE分析蛋白分子量分布，以及BCA法测定蛋白含量。此外，还评估了PDNV的血液相容性和不同条件下的储存稳定性。同时，对PDNV进行了转录组测序，通过GO、KEGG、eggNOG和NR数据库进行功能注释和物种来源分析，以探究其携带的mRNA组成与潜在功能。其次，从提取PDNV后的残渣中通过酶解、醇沉等方法制备了马齿苋多糖（POP），并利用红外光谱、离子色谱、高效凝胶渗透色谱（HPGPC）对其结构、单糖组成和分子量进行了表征，并测定了其血液相容性。第三，利用真空铸造法制备了三种微针：负载PDNV的POP-MNs-PDNV、不负载PDNV的空白POP-MNs，以及仅含HA的对照微针。对微针的载药量、流变学性质、形貌（SEM）、机械强度、吸湿性、穿刺性能、在皮肤内的溶解性以及皮肤刺激性进行了全面评价。第四，通过体外Franz扩散池实验和体内荧光示踪实验（使用Dio标记PDNV，RhB标记微针基质），系统地比较了POP-MNs-PDNV与PDNV水溶液在离体鼠皮和活体小鼠皮肤中的透皮渗透效率和分布深度。第五，在细胞水平上评估了PDNV和POP的抗炎作用及机制。使用人永生化角质形成细胞（HaCaT）和小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）。通过CCK-8法评估了PDNV和POP的细胞毒性，并通过共聚焦显微镜观察了Dio标记的PDNV被细胞摄取的过程。使用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激HaCaT细胞模拟炎症状态下的表皮细胞异常增殖，使用脂多糖（LPS）刺激RAW264.7细胞建立体外炎症模型。通过CCK-8法检测对HaCaT细胞增殖的抑制，通过Griess法检测RAW264.7细胞一氧化氮（NO）释放，通过ELISA检测TNF-α和白细胞介素-6（IL-6）水平。通过流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物CD86（M1型）和CD206（M2型），以评估PDNV和POP对巨噬细胞从促炎M1型向抗炎M2型极化的调节作用。此外，还对LPS诱导后经PDNV和/或POP处理的RAW264.7细胞进行了转录组测序，通过GO和KEGG富集分析寻找差异表达基因和相关信号通路。第六，建立了2,4-二硝基氯苯（DNCB）诱导的BALB/c小鼠AD模型。将小鼠随机分为6组：正常组、模型组、阳性药地塞米松（Dex）组、POP-MNs-PDNV治疗组、空白POP-MNs对照组和PDNV水溶液组。从建模第8天起，连续14天对各组小鼠进行背部给药治疗。通过观察皮肤外观、计算皮炎面积和严重程度指数（EASI）、测量经皮水分流失率（评估皮肤屏障功能）、称量脾脏计算脾指数来评价疗效。实验结束后，采集小鼠血清检测免疫球蛋白E（IgE）水平和肝肾功能指标（ALT, AST, TBIL, TP, CR, UR）；采集皮肤组织进行苏木精-伊红（H&E）染色和甲苯胺蓝染色观察组织病理学变化和肥大细胞浸润；通过ELISA和RT-qPCR检测皮肤组织中TNF-α、IL-4和IFN-γ等细胞因子的蛋白和mRNA表达水平；通过免疫组化（IHC）和Western blot（WB）检测皮肤组织中NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）以及STING蛋白的表达；通过免疫荧光检测皮肤中M1（CD86）和M2（CD206）型巨噬细胞的标志物。第七，通过观察连续7天使用微针后的小鼠皮肤反应以及分析主要器官的H&E染色切片，初步评估了POP-MNs-PDNV的皮肤和系统生物安全性。数据统计分析使用GraphPad Prism软件，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。

研究的主要结果丰富而系统。首先，成功提取了PDNV，其平均粒径为122.3±3.4 nm，呈典型茶托状，蛋白质分子量主要在95 kDa以下，在高达100 μg/ml浓度下溶血率低于5%，生物相容性良好，且冻干储存能更好保持稳定性。转录组分析显示，PDNV携带大量mRNA，NR注释分析发现其与蕨类植物（如水蕨、铁线蕨）的mRNA相似度最高，为马齿苋的物种鉴定和进化研究提供了线索。GO和KEGG分析提示PDNV携带的活性物质可能参与细胞代谢和免疫调节过程，特别是与免疫应答相关的基因富集于MAPK等信号通路。其次，成功制备了POP，其主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖组成，平均分子量为111.11 kDa，红外光谱证实其多糖结构特征。第三，成功制备了形态完整、阵列规则（11×11，针高800 μm）的POP-MNs-PDNV。与纯HA微针相比，POP的加入显著改善了微针基质的流变学性质（呈现剪切稀化的假塑性流体特性）、机械强度（穿刺力达0.617 N/针，远超穿透角质层所需阈值）和吸湿性（最大吸湿率<1.5%）。微针能在3分钟内于离体皮肤中完全溶解，并能在穿刺后1分钟内将标记的PDNV有效递送至皮肤真皮层。第四，透皮实验证实，POP-MNs-PDNV能显著增强PDNV的皮肤渗透。体内外实验均显示，PDNV水溶液主要滞留在表皮角质层，而POP-MNs-PDNV处理后，大量PDNV能在10分钟至1小时内快速穿透至真皮层，且能检测到完整纳米颗粒穿过皮肤。第五，细胞实验表明，PDNV和POP在安全浓度范围内均能被HaCaT和RAW264.7细胞有效摄取。它们能显著抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞异常增殖，以及LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α和IL-6。更重要的是，流式细胞术和细胞形态观察证实，PDNV和POP单独或联合使用，均能促进LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞从促炎的M1型（CD86+）向抗炎/修复的M2型（CD206+）极化，且两者联合显示出最强的协同效应。RAW264.7细胞的转录组测序进一步验证了这一发现，GO和KEGG富集分析显示，PDNV和POP处理（尤其是联合处理）能显著下调多个促炎基因（如TNF, IL-1β, IL-6, CCL2, CCL4, CCL5）的表达，并富集于TNF信号通路、NOD样受体信号通路和NF-κB信号通路等关键炎症通路，提示其抗炎作用与抑制NF-κB通路激活密切相关。第六，动物模型实验结果有力地支持了体外发现。POP-MNs-PDNV治疗能显著改善DNCB诱导的小鼠AD症状：减轻皮肤红斑、增厚和表皮脱落，降低EASI评分；减少经皮水分流失，修复皮肤屏障功能；降低脾脏指数和血清IgE水平，调节免疫失衡。在分子机制层面，POP-MNs-PDNV能显著下调皮损中促炎因子TNF-α和IL-4的蛋白及mRNA水平，上调抗炎因子IFN-γ的水平，纠正Th1/Th2免疫失衡。免疫组化和Western blot结果显示，模型组皮肤中NF-κB p65、p-NF-κB p65以及STING蛋白表达显著升高，而POP-MNs-PDNV治疗能有效抑制这些蛋白的表达，其抑制效果与阳性药地塞米松相当，且优于PDNV或POP单独使用。同时，免疫荧光显示POP-MNs-PDNV能增加皮肤中M2型巨噬细胞（CD206+）的比例，减少M1型巨噬细胞（CD86+），与体外巨噬细胞极化结果一致。第七，安全性评估显示，与长期使用地塞米松导致脾脏萎缩和肝肾功能指标（ALT, AST, CR, UR）异常升高不同，POP-MNs-PDNV治疗组小鼠的主要器官组织学未见异常，血清肝肾功能指标与正常组无显著差异。连续7天皮肤给药也未引起明显的皮肤刺激或损伤，表明该新型微针制剂具有良好的生物相容性。

本研究的结论是：成功开发了一种集成了马齿苋纳米囊泡（PDNV）和多糖（POP）的可溶性微针（POP-MNs-PDNV）递送系统，并将其应用于AD的治疗。该系统能有效克服PDNV的透皮屏障，显著增强其局部递送效率。PDNV和POP发挥协同抗炎作用，其机制涉及：1) 抑制NF-κB和STING信号通路的异常激活；2) 促进巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎/修复的M2表型极化；3) 调节Th1/Th2细胞因子平衡。最终，POP-MNs-PDNV在AD小鼠模型中展现出与糖皮质激素地塞米松相当的疗效，且未观察到明显的系统毒性，显示出更高的安全性。

本研究的科学价值与应用意义重大。在科学层面，它首次系统揭示了马齿苋来源纳米囊泡（PDNV）通过调节巨噬细胞极化及抑制NF-κB/STING通路治疗AD的分子机制，为植物外泌体在免疫性皮肤病治疗中的应用提供了新的理论依据和实验数据。同时，对PDNV的转录组分析为植物物种鉴定和进化研究提供了有价值的信息。在技术应用层面，研究创新性地将同一来源的活性成分（PDNV和POP）与可溶性微针技术相结合，构建了一个“自增强”的协同治疗平台：POP既作为功能性辅料改善了微针的物理性能，又与PDNV产生药理协同，而微针则高效解决了PDNV的透皮递送难题。这种“成分-剂型-功效”一体化的设计思路，为植物活性成分的高值化综合利用和新型透皮制剂开发提供了成功范式。该研究为解决AD临床治疗中疗效、安全性和依从性难以兼顾的痛点，提供了一种潜在的新型、高效、安全的天然药物递送与治疗策略。

本研究的亮点在于：1) 研究对象的创新性：聚焦于尚未被充分研究的马齿苋来源纳米囊泡（PDNV），挖掘其治疗AD的新用途，并结合同源多糖（POP）实现协同增效。2) 剂型设计的创新性与系统性：创造性地设计并全面表征了负载PDNV和POP的可溶性微针，实现了透皮递送效率与制剂机械性能的双重优化。3) 机制研究的深度与广度：从体外细胞摄取、增殖抑制、巨噬细胞极化、转录组测序，到在体动物模型的症状改善、免疫调节、信号通路抑制（NF-κB, STING）和巨噬细胞表型转换，形成了完整、多层次、相互印证的证据链，深入阐明了其多靶点作用机制。4) 显著的协同效应与安全性优势：明确证明了PDNV与POP、以及与微针递送系统之间的协同作用，疗效媲美激素但无其系统性副作用，凸显了其作为天然药物疗法的潜在优势。5) 完整的转化研究路径：涵盖了从活性成分提取表征、制剂工艺开发、体外评价、机制探索到体内药效和安全评价的全流程，为后续的临床转化奠定了坚实基础。