本文属于类型a，即单一原创研究论文的学术报告。
该研究由J. F. G. M. Wintermans和A. De Mots完成，作者单位是荷兰奈梅亨大学植物学系（Department of Botany, University of Nijmegen, Nijmegen, The Netherlands）。该论文于1965年发表在《Biochimica et Biophysica Acta》（生物化学与生物物理学报）第109卷第448至453页，论文标题为《Spectrophotometric characteristics of chlorophylls a and b and their pheophytins in ethanol》（叶绿素a和b及其脱镁叶绿素在乙醇中的分光光度特性）。
本研究属于植物生理学和光合色素分析化学领域。叶绿素a和b的定量测定通常通过有机溶剂提取叶片后，利用分光光度法进行。当时最广泛使用的溶剂是乙醚和80%丙酮，因为针对这些溶剂的比吸收系数已经得到较为仔细的研究。然而，在作者所从事的叶片和叶绿体脂类研究中，考虑到磷脂在丙酮中的溶解度较差，作者选择96%乙醇作为提取溶剂。当时已有文献中给出的乙醇中叶绿素的消光系数数据，但由于所用制剂纯度受到质疑，因此有必要重新测定乙醇中叶绿素的吸收特性。虽然Schötz曾发表过乙醇中叶绿素在红光最大吸收波长处的比吸收系数，但其数据不能用于同时测定叶片提取物中的叶绿素a和b。因此，本研究的目的是准确测定叶绿素a和b在96%乙醇中以及脱镁叶绿素a和b在80%乙醇–0.01 N盐酸中的吸收光谱和比吸收系数，并推导出同时测定叶绿素a和b的计算公式。
研究的工作流程包括植物材料的提取、色素的色谱分离纯化、纯度检验、吸收光谱测定以及比吸收系数计算等步骤。研究以苍耳（Xanthium pennsylvanicum）和菜豆（Phaseolus vulgaris）的新鲜叶片为材料，每份样品鲜重为0.5至1.0克。叶片首先在液氮中冷冻，并在石英砂和少量碳酸钙存在下用冷丙酮研磨，直至残渣无色。合并提取液后，将其与等体积的轻石油醚（沸程40–60°C）混合，再通过长颈漏斗导入足量蒸馏水中，进行液液分配。经过多次反复洗涤后，上层液体经无水硫酸钠干燥过滤，并蒸发浓缩至小体积。随后，使用干法填充的糖粉色谱柱（150×12 mm）进行色谱分离，柱先用轻石油醚处理。色素上样后，用含1%甲醇的轻石油醚进行展开。所有操作均在4°C的冷室中完成。
在获得色谱分离后的色素后，收集叶绿素所在色带的中央部分，干燥并充分混匀。取两份平行样品称重，分别用乙醚或96%乙醇提取并定容。使用Zeiss PMQ II分光光度计和1厘米玻璃比色皿，在700至400毫微米波长范围内读取吸收光谱。随后，向乙醇溶液中的叶绿素加入1/6体积的0.06 N盐酸，使叶绿素转化为脱镁叶绿素（pheophytin），并读取所得溶液的吸收光谱。在另外的实验中，部分样品用丙酮提取，并分别在100%和80%丙酮中测定叶绿素的吸收。以Smith等人测定的乙醚中的比吸收系数作为参考标准，计算叶绿素浓度，并据此计算叶绿素在96%乙醇、100%和80%丙酮中，以及脱镁叶绿素在80%乙醇–0.01 N盐酸中的消光系数。
纯度检验是本研究的重要环节。当制剂在乙醚中的吸收光谱与Smith、Benitez和Koski所测定的纯叶绿素光谱一致时，才可认为该制剂是纯的。论文表I列出了纯叶绿素、脱镁叶绿素和类胡萝卜素在乙醚中若干波长处的吸光度比值。对于叶绿素a，特别关注A430mμ/A662mμ和A410mμ/A662mμ这两个比值，因为它们可以在同一溶液中和仪器误差较小的光谱区域内测定。本研究中前者与预期值非常接近，后者若与Smith数据相比略有偏低，这反而加强了制剂纯度的可信度。A662mμ/A505mμ在某些测定中偏低，但平行测定间的差异所对应的505毫微米处吸光度差小于0.005，因此认为不存在显著的杂质污染。对于叶绿素b，单次色谱分离容易受到类胡萝卜素的污染。类胡萝卜素污染不会影响红光区吸收，但会干扰通过蓝光/红光吸收峰比值判断红光吸收杂质是否存在。本研究中叶绿素b制剂的蓝光/红光比值特别高，而红光吸收杂质如叶绿素a或脱镁叶绿素会强烈降低A454mμ/A430mμ比值。实际该比值变化很小，与类胡萝卜素在这些波长处吸光度下降的情况相符，因此可认为不存在能在红光峰处造成大于0.003吸光度的污染。因此，作者未进行进一步纯化。最终用于计算乙醇中比吸收系数的制剂在乙醚中的吸光度比值详见表II。
研究获得的主要结果体现在多个方面。在96%乙醇中，叶绿素a在红光最大吸收波长665毫微米处的比吸收系数为83.4 L·g⁻¹·cm⁻¹，叶绿素b在649毫微米处为24.6 L·g⁻¹·cm⁻¹。该叶绿素a数值与Schötz报道的83非常接近，但叶绿素b的数值及其最大吸收波长与该作者报道略有不同。脱镁叶绿素a在666毫微米处比吸收系数为50.4 L·g⁻¹·cm⁻¹，在655毫微米处为33.4 L·g⁻¹·cm⁻¹；脱镁叶绿素b在654–655毫微米处为23.0 L·g⁻¹·cm⁻¹，在666毫微米处为11.2 L·g⁻¹·cm⁻¹。这些脱镁叶绿素数值与Wickliff和Aronoff所测定的结果非常接近。在100%丙酮中，叶绿素a在662毫微米处的比吸收系数为91.8 L·g⁻¹·cm⁻¹，叶绿素b在645–646毫微米处为52 L·g⁻¹·cm⁻¹；在80%丙酮中，叶绿素a在664毫微米处为89.5 L·g⁻¹·cm⁻¹，叶绿素b在647–648毫微米处为51 L·g⁻¹·cm⁻¹。这些数值略低于Vernon采用类似技术并以相同乙醚比吸收系数为参考所得的结果，但显著高于McKinney的旧值。叶绿素a在100%丙酮中的本测定值显著低于Holm的结果，后者超过乙醚中的数值，可能是由于色素从稀丙酮溶液转移到乙醚过程中发生损失所致。
表V列出了叶绿素a和b在96%乙醇中以及脱镁叶绿素a和b在80%乙醇–0.01 N盐酸中的主要比吸收系数。叶绿素a在乙醇中的蓝光峰与红光峰比值约为1.00，与Harris和Zscheile的结果一致；叶绿素b的蓝光/红光峰比值估计为2.68。叶绿素a的短波紫光峰仅比主峰略低，这在乙醇中是符合预期的。
基于这些吸收系数，作者推导出用于测定96%乙醇植物提取物中叶绿素a和b的联立方程： Ca = 13.70 A665mμ − 5.76 A649mμ，单位为μg/ml； Cb = 25.80 A649mμ − 7.60 A665mμ，单位为μg/ml； Ca+b = 6.10 A665mμ + 20.04 A649mμ，单位为μg/ml； 以及Ca+b = 1000 A654mμ / 39.8，单位为μg/ml。
这些公式可用于同时测定乙醇提取液中叶绿素a和b的浓度。作者指出，将本公式应用于实际样品所得结果与其他提取溶剂对应公式所得结果的比较，将在后续论文中讨论。
本研究的意义主要体现在三个方面。第一，通过严格的纯度检验和以乙醚中已知比吸收系数为参考，提供了可靠的叶绿素a和b在96%乙醇中的比吸收系数，解决了此前文献数据因制剂纯度问题而不可靠的缺陷。第二，研究中同时给出了在80%乙醇–0.01 N盐酸体系中脱镁叶绿素a和b的比吸收系数，为分析叶绿素降解产物提供了数据基础。第三，推导出的联立方程使得在96%乙醇提取体系中可以同时测定叶绿素a和b，对于以乙醇为提取溶剂的叶片和叶绿体脂类研究具有直接的方法学应用价值。
本研究的重点与特色在于：其一，作者采用糖粉色谱纯化方法结合乙醚光谱纯度检验，系统排除了脱镁叶绿素和类胡萝卜素等可能的杂质干扰；其二，作者将叶绿素转化为脱镁叶绿素后测定其在80%乙醇–0.01 N盐酸中的吸收特性，扩展了分析范围；其三，作者同时给出了100%和80%丙酮中的比吸收系数，并与前人数据进行了系统比较，进一步验证了方法的可靠性。
此外，论文还指出，脱镁叶绿素的比吸收系数未对镁丢失造成的质量变化进行校正。研究过程中C. Posthumus女士参与了部分实验工作，作者在致谢中表达了感谢。总体而言，该研究为乙醇提取体系中叶绿素和脱镁叶绿素的分光光度定量分析提供了准确的基础数据和计算公式，对光合作用研究和植物色素分析具有长期的方法学参考价值。