本文由Xiaolan Zhu、Wenxin Li、Minjun Lu等来自江苏大学附属第四医院（镇江市妇幼保健院）生殖医学中心和中心实验室的研究人员团队完成，发表于Journal of Nanobiotechnology期刊2024年第22卷。该研究是一项针对早发性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency, POI）发病机制与潜在治疗的原创性基础与临床前研究。

研究背景 早发性卵巢功能不全（POI）是导致女性不孕的重要原因之一，严重影响患者身心健康。其病因复杂，其中卵巢颗粒细胞（Granulosa Cells, GCs）功能障碍是关键环节。氧化应激（Oxidative Stress）诱导的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）过量产生，可导致GCs线粒体损伤、细胞衰老乃至凋亡，进而引发POI。目前临床治疗方法存在局限性，无法有效恢复卵巢生理功能。近年来，人脐带间充质干细胞来源的外泌体（Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell-derived Exosomes，HucMSCs-Exs或H-Exs）因其具有低免疫原性、高生物相容性及强大的旁分泌调控能力，在多种疾病治疗中展现出潜力，但其改善POI卵巢功能的具体分子机制尚不明确。

非编码RNA（Non-coding RNA），特别是环状RNA（circular RNAs， circRNAs），在多种生物过程中扮演重要角色。circRNAs具有闭合环状结构，稳定性高，可作为竞争性内源RNA（ceRNA）吸附微小RNA（miRNAs），从而调控靶基因表达。同时，RNA的N6-甲基腺苷（m6A）修饰是关键的转录后调控机制，影响RNA的稳定性、出核和翻译等过程。有研究表明，m6A水平异常与POI有关。然而，外泌体circRNAs通过m6A修饰调控POI发生发展的具体机制仍是未知领域。

基于以上背景，本研究旨在探究H-Exs是否能够通过递送特定的circRNA来改善氧化应激诱导的颗粒细胞损伤和线粒体功能障碍，从而治疗POI。研究团队通过生物信息学分析筛选出在POI患者GCs中显著下调的circRNA——hsa_circ_0043949（命名为circBRCA1），并围绕其展开深入机制探索。

详细研究流程 本研究采用了临床样本分析、体外细胞实验和体内动物模型相结合的综合研究策略，流程严谨，层层递进。

第一阶段：临床样本分析与初步筛选。 1. 研究对象：研究纳入了100名接受体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植（IVF/ICSI-ET）的女性，其中50名为POI患者（POI组），50名为卵巢储备功能正常的对照组（NC组）。两组在年龄和BMI上无显著差异。 2. 样本处理：收集所有受试者月经周期第2-3天清晨空腹血清，并在取卵日收集颗粒细胞。所有样本采集均经过伦理委员会批准，并获得知情同意。 3. 数据分析与筛选： * 从GEO数据库获取老年女性与年轻女性颗粒细胞的circRNA测序数据（GSE97193），进行差异表达分析，发现179个差异表达的circRNAs，其中61个下调。 * 通过RT-qPCR在POI患者和对照组的血清及颗粒细胞中验证候选circRNA的表达。结果显示，hsa_circ_0043949（circBRCA1）在POI组中表达显著降低，且与卵巢储备功能指标（如AMH、AFC呈正相关，与FSH、LH呈负相关）密切相关。 * 利用生物信息学数据库（miRanda）预测可能与circBRCA1结合的miRNAs。

第二阶段：circBRCA1的鉴定与H-Exs功能的体外验证。 1. 细胞模型：使用人颗粒细胞系KGNs构建氧化损伤模型（用H2O2处理，简称H2O2-KGNs）。 2. H-Exs的分离与表征：从培养至第3-5代的HucMSCs上清中提取外泌体（H-Exs）。通过透射电镜（TEM）观察其形态（球形双层膜），纳米颗粒追踪分析（NTA）测定其粒径（约100nm），并通过蛋白质印迹法（Western Blot）检测其标志蛋白CD9和CD63的表达，以确认为外泌体。 3. circBRCA1分子特性鉴定： * 来源与结构：通过Sanger测序证实circBRCA1由BRCA1基因的第19-21号外显子反向剪接形成，长度为213bp。 * 稳定性验证：使用放线菌素D（ActD）抑制转录后，circBRCA1的半衰期远长于其线性mRNA；用RNase R处理，circBRCA1能抵抗降解，而线性mRNA被消化。这证实了其环状结构的稳定性。 * 亚细胞定位：通过核质分离实验和RNA荧光原位杂交（FISH）发现，circBRCA1主要定位于细胞质，提示其可能发挥ceRNA功能。 4. H-Exs功能验证：将H-Exs与H2O2-KGNs共培养，发现H-Exs可以被细胞有效摄取，并能显著缓解H2O2引起的ROS升高、细胞衰老（SA-β-gal活性增加、p16/p21表达上调）、线粒体膜电位（JC-1检测）下降、氧消耗率（OCR）和ATP水平降低等系列损伤。当使用GW4869抑制HucMSCs释放外泌体后，其修复作用被削弱，证明H-Exs是发挥修复作用的关键介质。 5. circBRCA1在H-Exs修复中的作用： * 通过RT-qPCR发现，H2O2处理降低了KGNs中circBRCA1的表达，而H-Exs共培养可逆转这一现象。circBRCA1在HucMSCs和H-Exs中高表达。 * 功能丧失实验：在HucMSCs中敲低（knockdown, KD）circBRCA1后，收集其外泌体（H-Exs-si-circBRCA1）与H2O2-KGNs共培养。结果显示，与普通H-Exs相比，H-Exs-si-circBRCA1的修复效果显著减弱（ROS清除能力下降、抗氧化酶SOD2/GPx表达降低、细胞衰老加重、线粒体功能指标恶化）。这直接证明外泌体来源的circBRCA1是H-Exs发挥保护作用的核心分子。

第三阶段：机制探究——circBRCA1/miR-642a-5p/FOXO1轴。 1. ceRNA网络构建： * 结合GEO数据库中老年与年轻女性卵泡液miRNA测序数据（GSE63737）和生物信息学预测，筛选出与circBRCA1结合且在高龄女性中上调的miRNA——miR-642a-5p。 * 临床样本验证：miR-642a-5p在POI患者血清和颗粒细胞中表达显著升高。 * 结合验证：通过双荧光素酶报告基因实验和RNA Pull-down实验，证实circBRCA1可直接与miR-642a-5p结合。 2. 下游靶基因鉴定： * 利用TargetScan和miRWalk数据库预测miR-642a-5p的靶基因，结合文献中FOXO1在氧化应激调控中的作用，将其锁定为候选靶点。 * 通过双荧光素酶报告基因实验和RNA Pull-down实验，证实miR-642a-5p可直接靶向结合FOXO1 mRNA的3‘UTR区。 * 功能实验：在H2O2-KGNs中，抑制miR-642a-5p可上调FOXO1表达，并部分逆转由circBRCA1敲低或FOXO1敲低引起的氧化损伤、细胞衰老和线粒体功能障碍。反之，过表达miR-642a-5p或敲低FOXO1则会加重损伤。这完整地证明了“circBRCA1吸附miR-642a-5p，从而解除其对FOXO1的抑制”这一调控轴。

第四阶段：上游调控机制——FTO介导的m6A去甲基化。 1. m6A修饰预测与验证：使用在线工具预测发现circBRCA1序列上存在潜在的m6A修饰位点。 2. 关键“擦除器”（Eraser）鉴定：在HucMSCs中分别敲低两个主要的m6A去甲基酶FTO和ALKBH5。结果发现，只有敲低FTO会显著降低circBRCA1的m6A修饰水平，并同时降低circBRCA1的表达量和稳定性。而使用m6A甲基化抑制剂DAA处理可增加circBRCA1表达。这表明FTO通过介导circBRCA1的m6A去甲基化来增强其稳定性。 3. FTO的功能验证：在HucMSCs中敲低FTO后，收集其外泌体（H-Exs-si-FTO）与H2O2-KGNs共培养。结果显示，H-Exs-si-FTO的修复效果与H-Exs-si-circBRCA1类似，均显著弱于普通H-Exs。同时，共敲低FTO和circBRCA1并未产生叠加效应。这表明FTO通过调控circBRCA1来影响H-Exs的功能。

第五阶段：体内动物模型验证。 1. POI大鼠模型建立与治疗：使用环磷酰胺（CTX）腹腔注射建立POI大鼠模型。将模型鼠随机分为四组，分别通过尾静脉注射PBS、普通H-Exs、H-Exs-si-circBRCA1或H-Exs-si-FTO。 2. H-Exs体内分布：注射DIR荧光标记的H-Exs后，活体成像显示H-Exs在卵巢部位有特异性富集，并与颗粒细胞标志物FSHR共定位。 3. 疗效评估： * 卵巢功能：与PBS组相比，H-Exs治疗能显著改善POI大鼠的动情周期紊乱、恢复血清AMH、E2水平，降低FSH、LH水平，增加卵巢重量和各级卵泡（特别是窦卵泡）数量，提高后续的受孕率和产仔数。而H-Exs-si-circBRCA1和H-Exs-si-FTO组的改善效果有限。 * 颗粒细胞状态：H-Exs治疗能降低卵巢组织ROS水平、减少衰老细胞（SA-β-gal染色阳性）、改善颗粒细胞线粒体形态、促进细胞增殖（Ki67阳性）、减少凋亡（TUNEL阳性）。这些效应在circBRCA1或FTO敲低的H-Exs处理组中被削弱。 * 机制轴验证：大鼠卵巢组织中，H-Exs组circBRCA1和FOXO1蛋白表达上调，miR-642a-5p表达下调，而H-Exs-si-circBRCA1和H-Exs-si-FTO组则逆转了这一趋势，与体外实验结果一致。

主要研究结果 1. 临床相关性发现：circBRCA1在POI患者血清和颗粒细胞中表达显著降低，其表达水平与AMH、AFC等卵巢储备功能正相关指标呈正相关，与FSH、LH等负相关指标呈负相关，提示其作为POI潜在生物标志物的价值。 2. H-Exs的保护作用：H-Exs能够被氧化损伤的颗粒细胞内化，有效改善其线粒体功能障碍，抑制ROS积累和细胞衰老。 3. 关键分子circBRCA1：circBRCA1是H-Exs发挥保护作用的核心效应分子。其表达下调会削弱H-Exs的治疗效果。 4. ceRNA调控轴：circBRCA1通过直接吸附miR-642a-5p，解除其对转录因子FOXO1的抑制，从而上调FOXO1表达，这是其发挥抗氧化、抗衰老、改善线粒体功能作用的直接下游通路。 5. 上游表观转录调控：m6A去甲基酶FTO通过降低circBRCA1转录本的m6A修饰水平，增强其稳定性，从而促进其在HucMSCs中的表达和外泌体分泌。FTO表达下调（如在POI状态下）会导致circBRCA1减少。 6. 体内疗效证实：在CTX诱导的POI大鼠模型中，外源性补充H-Exs能有效恢复卵巢功能和生育力，而敲低circBRCA1或FTO的H-Exs则疗效甚微，在动物整体水平验证了该机制轴的重要性。

研究结论 本研究揭示了人脐带间充质干细胞来源外泌体治疗早发性卵巢功能不全的一种新机制：外泌体携带的circBRCA1（受FTO介导的m6A去甲基化调控）通过充当miR-642a-5p的“海绵”，上调FOXO1的表达，从而抵抗氧化应激对颗粒细胞的损伤，改善线粒体功能，延缓细胞衰老，最终保护卵巢功能。该研究不仅阐明了circBRCA1/miR-642a-5p/FOXO1轴在POI病理过程中的重要作用，还首次将m6A修饰、circRNA和外泌体三者联系起来，为POI的发病机制提供了新的理论视角。

研究价值与亮点 1. 科学价值： * 机制创新：首次系统阐释了H-Exs通过递送m6A修饰调控的circRNA来改善POI的完整信号轴（FTO-m6A-circBRCA1-miR-642a-5p-FOXO1），将表观转录调控、非编码RNA、细胞外囊泡和生殖内分泌疾病巧妙连接，机制研究深入、逻辑链条完整。 * 靶点发现：鉴定出circBRCA1作为POI的潜在诊断生物标志物和治疗靶点。 * 理论补充：深化了对POI中颗粒细胞线粒体功能障碍和衰老分子机制的理解，特别是非编码RNA和RNA修饰在其中扮演的角色。 2. 应用价值： * 治疗策略：为基于HucMSCs-Exs的POI无细胞治疗方案提供了坚实的理论依据和具体的效应分子（circBRCA1），具有转化应用前景。 * 诊断潜力：血清circBRCA1水平有望成为评估卵巢储备功能和非侵入性诊断POI的新型指标。 3. 研究亮点： * 多维度验证：研究结合了临床样本分析、生物信息学挖掘、体外细胞功能实验和体内动物模型，从相关性到因果性进行了充分论证。 * 技术方法全面：运用了外泌体分离表征、circRNA鉴定、FISH、双荧光素酶、RNA Pull-down、MeRIP、线粒体功能检测（OCR、JC-1、ATP）、组织病理等多种分子与细胞生物学技术。 * 临床关联性强：始于临床问题（POI患者circRNA差异），终于临床意义（标志物关联分析和动物治疗），体现了转化医学的研究思路。

该项研究是一项设计周密、机制深入、意义重要的优秀工作，为POI的精准诊断和靶向治疗开辟了新的可能路径。