学术研究报告：一氧化氮对Leber遗传性视神经病变患者视网膜类器官代谢及存活的影响

作者及发表信息
本研究由日本神户大学医学部眼科学系的Fumio Takano、Megumi Kitamura、Kaori Ueda和Makoto Nakamura共同完成，于2025年5月20日发表在*The American Journal of Pathology*（DOI: 10.1016/j.ajpath.2025.05.006）。研究得到日本学术振兴会（JSPS）的资助（项目编号21K16871）。

学术背景
Leber遗传性视神经病变（Leber hereditary optic neuropathy, LHON）是一种与线粒体DNA（mtDNA）突变相关的双侧视神经病变，主要影响青年男性，全球患病率约1:50,000。其临床特征包括急性期视盘周围毛细血管扩张（parapapillary telangiectasia），但具体机制尚不明确。LHON的病理机制涉及线粒体电子传递链复合体I功能异常，导致活性氧（ROS）积累和视网膜神经节细胞（RGC）凋亡。然而，环境或遗传触发因素（如吸烟、激素）的作用仍需探索。

本研究假设一氧化氮（nitric oxide, NO）可能通过血管扩张和神经毒性双重作用参与LHON的急性期病理过程。为验证这一假设，团队利用患者来源的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）分化为三维视网膜类器官（retinal organoids, ROs），分析NO暴露对细胞代谢、线粒体功能及存活的影响。

研究流程与方法
1. iPSCs建立与视网膜类器官分化
- 样本来源：3名携带m.11778G>A突变的LHON患者和3名健康对照者的外周血单核细胞，通过电穿孔导入重编程因子（OCT3/4、SOX2等）生成iPSCs。
- 分化方法：采用无血清悬浮培养快速聚集体（SFEBq）法，分阶段诱导iPSCs形成视网膜类器官。第6天添加BMP4促进神经外胚层分化，第21天切换为含视黄酸和牛磺酸的培养基以支持视网膜特异性发育。免疫组化验证类器官表达视网膜标志物（RX、CRX、Math5等）。

1. NO暴露实验设计

   • 暴露条件：
     
     • 急性暴露：24小时不同浓度（0.1–10 mM）的NO供体硝普钠（sodium nitroprusside, SNP）。
       
     • 间歇暴露：3次24小时1 mM SNP暴露，间隔24小时恢复期。
       
     • 持续暴露：72小时连续1 mM SNP处理。
       

2. 检测指标

   • 细胞凋亡：TUNEL染色定量凋亡细胞比例，ImageJ分析阳性区域。
     
   • 线粒体DNA拷贝数：实时定量PCR比较mtDNA与核DNA（ndNA）比值，使用ND1/SLCO2B1和ND5/SERPINA1引物对。
     
   • 代谢组学分析：气相色谱-质谱（GC-MS）检测小分子代谢物，通过MetaboAnalyst 6.0进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），筛选差异代谢物（如牛磺酸、GABA）。
     

主要结果
1. 形态学与基线差异
- LHON组ROs的基线mtDNA拷贝数显著高于对照组（52.1 vs. 47.4 copies/cDNA, p=3.99×10⁻³），但凋亡率无差异。
- SNP暴露后，LHON组ROs外层视网膜结构破坏更显著（图2A），尤其在≥1 mM SNP时出现萎缩性改变（图3B）。

1. 凋亡与线粒体响应

   • SNP剂量依赖性增加凋亡，且LHON组增幅更大（混合效应模型, p=3.53×10⁻⁷）。72小时持续暴露仅LHON组凋亡显著上升（p=1.95×10⁻²）。
     
   • 间歇暴露后，两组mtDNA拷贝数均增加（p=3.91×10⁻³），但持续暴露仅对照组显著升高（p=1.25×10⁻²），提示LHON组线粒体代偿能力受限。
     

2. 代谢组学特征

   • 牛磺酸（taurine）、GABA和烟酰胺（niacinamide）在LHON组基线水平较低，SNP暴露后进一步降低（VIP评分>1）。
     
   • 代谢通路富集分析显示，Warburg效应（乳酸代谢）和牛磺酸代谢通路异常激活（图6），可能与能量代谢障碍相关。
     

结论与意义
本研究首次通过患者特异性ROs模型揭示NO在LHON中的双重作用：
- 科学价值：证实NO通过破坏代谢稳态（如牛磺酸缺乏）和加剧线粒体功能障碍，促进LHON视网膜细胞凋亡。
- 临床意义：为靶向NO通路（如抑制过度产生或补充牛磺酸）的治疗策略提供实验依据。
- 创新点：
1. 结合iPSCs与代谢组学，模拟LHON急性期病理。
2. 发现mtDNA拷贝数代偿性增加是LHON的早期特征，但持续NO压力导致代偿失效。

局限性：未直接验证视网膜毛细血管NO释放，且ROs成熟度有限。未来需在动物模型中验证NO的时空动态。

亮点总结
1. 方法创新：SFEBq分化联合多组学分析，为遗传性眼病研究提供新范式。
2. 发现突破：揭示牛磺酸代谢缺陷是LHON的潜在生物标志物和治疗靶点。
3. 临床关联：解释了LHON急性期视盘周围血管扩张的NO依赖机制。

此研究为理解LHON的复杂病理机制开辟了新视角，并强调了代谢干预在神经退行性疾病中的潜在价值。