学术研究报告：关于CCR5调控记忆关联时间窗口的分子与细胞机制
一、 作者、机构与发表信息
本研究由来自多个机构的合作团队完成，主要通讯作者为 Miou Zhou（任职于Western University of Health Sciences）和 Alcino J. Silva（任职于University of California Los Angeles）。第一作者为 Yang Shen 和 Miou Zhou。研究团队的其他成员来自University of California Los Angeles、Icahn School of Medicine、Korea Advanced Institute of Science and Technology等多个知名研究机构。
该研究成果以题为“CCR5 closes the temporal window for memory linking”的论文形式，于2022年6月2日正式发表在顶级学术期刊 《Nature》 第606卷上。
二、 学术背景与研究目的
科学领域与背景知识： 本研究属于神经科学与学习记忆领域的交叉研究。在现实世界中，记忆并非孤立形成或提取。时间（Temporal Proximity）是记忆组织的一个关键变量：在相近时间内经历的事件更有可能被有意义地关联起来，形成“记忆关联”（Memory Linking），而间隔较长的事件则不会。这种机制对于构建连贯的经验和知识至关重要。已有研究表明，大脑通过增强神经元兴奋性（如激活cAMP response element-binding protein, CREB）来“打开”记忆关联的时间窗口，使得编码第一个记忆的神经元集群（Ensemble）更有可能参与编码紧随其后形成的第二个记忆，从而产生记忆痕迹的重叠（Overlap），这是记忆关联的神经基础。然而，大脑如何“关闭”这个时间窗口，将时间上间隔较远的事件记忆分离开来，其分子和细胞机制此前尚不清楚。
研究动机与目标： 本研究旨在探索大脑如何将时间上分离的事件记忆进行区隔。研究者将目光投向CCR5（C-C chemokine receptor type 5）。CCR5是一种众所周知的免疫受体，是HIV感染的辅助受体，但其在学习记忆中的作用知之甚少。有趣的是，CCR5及其配体CCL5在海马体CA1区高度富集，且已有证据表明CCR5是CREB活化和神经元兴奋性的负调控因子。基于此背景，本研究提出核心科学问题：CCR5是否以及如何参与调控记忆关联的时间窗口？ 研究目标是阐明CCR5在记忆形成后的动态变化如何影响神经元兴奋性、记忆分配（Memory Allocation）和记忆痕迹重叠，最终决定记忆关联的时间窗口，并探究其在年龄相关的记忆关联缺陷中的作用。
三、 详细研究流程与方法
本研究是一个综合性的系统研究，结合了分子生物学、行为学、光遗传学、化学遗传学、在体钙成像和电生理学等多种技术，流程复杂且环环相扣。主要流程可分为以下几个关键部分：
1. 探究CCR5在学习后的表达与激活动态： * 研究对象与方法： 使用成年C57BL/6小鼠。首先，通过情景恐惧条件化（Contextual Fear Conditioning）建立记忆模型。在不同时间点（3, 6, 12, 24小时后）采集小鼠背侧海马CA1区（dCA1）组织。 * 实验内容： * 定量PCR（qPCR）： 检测CCR5及其配体（CCL5, CCL3, CCL4, CCL11）的mRNA水平变化。 * 原位杂交（In Situ Hybridization）： 精确定位CCR5和CCL5的表达是在神经元还是在小胶质细胞中，并分析学习后其细胞分布的变化。 * 开发并使用CCR5-iTango2系统： 这是一个本研究开发的新型遗传学工具，用于在体、实时监测CCR5的配体依赖性激活。该系统将CCR5与一个光控和配体控的基因表达报告系统（iTango2）耦合。只有当CCR5被其配体（如CCL5）激活且同时有蓝光照射时，报告基因EGFP才会表达。研究者首先在HEK293细胞和小脑齿状回验证了该系统的特异性和有效性，随后将其病毒注射到小鼠dCA1区。三周后对小鼠进行训练，并在不同时间点给予蓝光刺激，通过检测EGFP的表达水平来量化学习后神经元CCR5的激活动态。
2. 行为学验证CCR5对记忆关联时间窗口的调控： * 研究对象： 包括野生型小鼠、CCR5基因敲除（CCR5⁻/⁻）小鼠、CCL5基因敲除（CCL5⁻/⁻）小鼠，以及通过病毒介导在dCA1区进行特定操控的小鼠。 * 核心行为范式——情景记忆关联任务： 小鼠先后探索两个不同的环境（环境A和环境B），间隔时间从5小时到7天不等。几天后，在环境B中给予一次即刻电击，形成恐惧记忆。最后，测试小鼠在环境A（未直接与电击关联）中的僵直（Freezing）行为。若小鼠能将环境A的记忆与环境B的电击记忆关联起来，则在环境A中也会表现出高水平的僵直。 * 操控与实验分组： * 增强CCR5信号： (a) 在探索环境A后4小时，向dCA1区注射CCL5配体；(b) 使用光遗传学工具Opto-CCR5（本研究采用的另一个新颖工具，将CCR5的胞内信号域与视紫红质融合，用光特异性激活CCR5下游通路）选择性激活dCA1神经元中的CCR5信号。 * 抑制CCR5信号： (a) 向dCA1区注射靶向CCR5的短发夹RNA（shRNA）病毒，敲低CCR5表达；(b) 使用CCR5⁻/⁻小鼠；© 使用FDA已批准的CCR5拮抗剂马拉维若（Maraviroc）。 * 拓展验证： 还开发了一个基于位置偏好和糖精水奖赏的“食欲性记忆关联任务”，以验证CCR5的作用是否具有普遍性。
3. 探究CCR5调控记忆关联的下游细胞机制： * 对神经元兴奋性的影响： 从急性海马脑片中记录dCA1锥体神经元，比较用CCL5处理1小时后与对照组的神经元在电流注射下的放电频率变化。 * 对记忆分配的影响： * 使用Opto-CCR5系统，在动物探索新环境前用光激活dCA1中表达Opto-CCR5的神经元，然后检测这些神经元中学习诱导的c-Fos（记忆参与神经元的标记物）表达是否减少。 * 向dCA1注射CCR5 shRNA病毒，比较CCR5被敲低的神经元与对照神经元参与记忆（表达c-Fos）的概率。 * 对记忆痕迹重叠的直接测量： * 分子标记法： 使用cFos-tTA转基因小鼠系统特异性标记环境A的记忆痕迹神经元（表达mCherry），然后通过原位杂交检测这些神经元在经历环境B后表达Fos mRNA（环境B的记忆痕迹标记）的比例，从而计算两个记忆痕迹的重叠度，并同时检测CCR5在这些神经元中的表达。 * 在体钙成像法（核心创新方法）： 在小鼠dCA1区注射GCaMP6f钙指示剂病毒并植入微型显微镜（Miniscope）。当小鼠探索环境A和环境B时，实时记录大量神经元的钙活动。通过自主研发的数据分析流程（包括运动校正、CNMF-E算法提取神经元信号、跨会话神经元匹配等），精确计算在两种环境中都活跃的神经元比例，即神经集群重叠指数（Overlapping Index）。分别在野生型和CCR5⁻/⁻小鼠中进行此实验，比较其重叠指数随时间间隔（5小时 vs. 数天）的变化模式。
4. 探究CCR5在年龄相关记忆关联缺陷中的作用： * 研究对象： 年轻（3-5月龄）和中年（16-18月龄）小鼠。 * 实验内容： (a) 比较年轻和中年小鼠dCA1区基础及学习后CCR5/CCL5的表达水平（qPCR和原位杂交）；(b) 测试中年野生型和CCR5⁻/⁻小鼠在5小时间隔下的记忆关联能力；© 向中年小鼠dCA1区注射马拉维若（Maraviroc），测试其能否挽救记忆关联缺陷。
四、 主要研究结果
1. CCR5在学习后呈现延迟性表达与激活增加。 qPCR和原位杂交结果显示，在情景恐惧条件化后12-24小时，dCA1区神经元（主要是兴奋性神经元）中CCR5和CCL5的mRNA表达显著升高。利用新型CCR5-iTango2系统进一步证实，神经元CCR5的配体依赖性激活也在学习后12-24小时逐渐增强。这表明记忆形成后，dCA1神经元中存在一个延迟的CCL5-CCR5信号增强时间窗。
2. CCR5的活性直接决定记忆关联时间窗口的开关。 行为学实验获得了一系列关键证据：当两个环境间隔5小时，对照组小鼠表现出成功的记忆关联（在环境A中高僵直）；间隔1天或更长时，关联消失。增强CCR5信号（注射CCL5或光遗传激活Opto-CCR5）能“提前关闭”窗口，即使在5小时间隔下也损害了记忆关联。相反，抑制CCR5信号（敲低、基因敲除或使用拮抗剂）能“延长”窗口，即使在野生型小鼠无法关联的1天或7天间隔下，也能诱导出强大的记忆关联。在食欲性任务中得到了相同结论，证明了CCR5作用的普遍性。这些结果强有力地证明了CCR5是设定记忆关联时间窗口持续时间的关键分子。
3. CCR5通过降低神经元兴奋性来调控记忆分配，减少记忆痕迹重叠。 电生理实验证实，用CCL5处理可显著降低dCA1神经元的放电频率。光遗传激活Opto-CCR5或敲低CCR5的实验分别显示，CCR5活性可以负向或正向调控神经元参与新记忆形成的概率（即记忆分配）。分子标记实验发现，在两个记忆痕迹中不重叠的神经元里，CCR5的表达概率显著高于重叠的神经元，且第一个记忆痕迹神经元中CCR5的表达水平与两个痕迹的重叠概率呈负相关。最直接的证据来自在体钙成像：野生型小鼠中，随着两个环境间隔时间从5小时延长到2天，其dCA1区活跃神经元集群的重叠指数显著下降；然而，在CCR5⁻/⁻小鼠中，这种时间依赖性的重叠下降被显著削弱，它们在不同时间间隔下都保持了较高的神经集群重叠。这些结果串联起完整的机制链条：学习后延迟升高的CCR5活性 → 降低神经元兴奋性 → 减少同一批神经元参与编码后续记忆的概率（记忆分配改变） → 降低不同记忆痕迹之间的神经重叠 → 最终关闭记忆关联的时间窗口。
4. 年龄相关的CCR5/CCL5上调导致记忆关联缺陷，并可被药物逆转。 研究发现，中年小鼠dCA1区神经元的基础CCR5和CCL5表达水平显著高于年轻小鼠，且学习后CCL5的表达高峰提前。行为上，中年野生型小鼠即使在5小时间隔下也表现出记忆关联缺陷。然而，中年CCR5⁻/⁻小鼠或使用FDA批准的CCR5拮抗剂马拉维若（Maraviroc） 处理的中年野生型小鼠，其记忆关联能力得到显著恢复。这直接将基础研究发现与年龄相关的认知衰退联系起来，并提示了潜在的治疗途径。
五、 结论与价值
本研究得出的核心结论是：记忆形成后，dCA1区记忆痕迹神经元中CCL5-CCR5信号的延迟性（12-24小时）增强，通过降低神经元兴奋性来负调控后续记忆的分配，从而减少不同记忆痕迹之间的神经集群重叠，最终关闭了记忆关联的时间窗口，使得时间上分离的事件记忆得以被大脑区隔。
科学价值： 1. 揭示了记忆分离的主动机制：首次阐明了大脑主动“关闭”记忆关联时间窗口的分子与细胞机制，弥补了长期以来对记忆分离机制认识的不足，为理解记忆的时间组织提供了全新视角。 2. 发现了CCR5在学习记忆中的新功能：将CCR5从一个经典的免疫/HIV受体，拓展为关键的记忆时间编码分子，深化了对免疫分子在大脑高级功能中作用的理解。 3. 构建了从分子到行为的多层次机制模型：将CCR5信号、神经元兴奋性、记忆分配、神经集群重叠和记忆关联行为巧妙地串联成一个完整、清晰的因果链条，研究设计严谨，证据链完整。
应用与转化价值： 1. 为年龄相关记忆障碍提供了新靶点和新策略：研究直接证明年龄相关的CCR5上调是导致记忆关联缺陷的原因之一，并且使用已上市的CCR5拮抗剂马拉维若可以挽救这一缺陷。这为治疗年龄相关的记忆碎片化、 relational memory障碍等提供了极具转化潜力的新方向。 2. 为相关精神疾病提供见解：文中提到，异常的 memory linking（如不当的关系记忆）与创伤后应激障碍（PTSD）、精神分裂症等疾病有关。本研究揭示的机制可能为理解这些疾病的病理生理学提供新线索。
六、 研究亮点