学术报告
一、研究概述与发表信息
本研究的核心作者为刘博实（Boshi Liu）和张来平（Laiping Zhang）（并列第一作者），通讯作者为陈欣（Xin Chen）、李晓辉（Xiaohui Li）及曹大雁（Dayan Cao）（主要联络人）。研究团队主要来自中国人民解放军陆军军医大学药学院药剂学系药物研究所，以及重庆医药高等专科学校重庆市药物工程研究中心和美国印第安纳大学医学院儿科系。该研究成果于2025年发表于Journal of Translational Medicine期刊。
二、研究背景与科学问题
心肌梗死（Myocardial infarction, MI）是全球性的重大健康负担，年发病人数约一千万，死亡率高达20%。现有的临床疗法难以理想地遏制疾病进展。近年来，细胞疗法通过在旁分泌作用（paracrine action）、替代受损心肌组织以及重建细胞外基质等方面显示出积极效果，为MI治疗带来了新希望。然而，细胞疗法的临床应用受限于细胞安全性、递送方式以及心脏的特殊结构与功能（如持续跳动、血流冲刷及缺血微环境）导致的细胞移植和存活率低等问题。
在心脏发育过程中，心内膜细胞（endocardial cells, ECCs）扮演着至关重要的角色，它们是心脏瓣膜、内皮细胞和心内膜下组织的来源，也是冠状动脉内皮细胞的关键来源，对心肌细胞（cardiomyocytes, CMs）的成熟至关重要。尽管同为间充质来源的心外膜细胞（epicardial cells）已被证实对MI有保护作用，但ECCs在MI治疗中的特定作用尚未见报道。因此，本研究旨在探索人胚胎干细胞来源的心内膜细胞（human embryonic stem cell-derived endocardial cells, hESC-ECCs）是否对MI具有保护作用，并为此开发了一种新型细胞递送系统。
三、详细研究方法与工作流程
本研究主要包含三个核心环节：水凝胶递送系统的构建与表征、hESC-ECCs的定向分化、以及大鼠MI模型的体内治疗与机制探究。
1. 光敏性互穿网络水凝胶递送系统的制备与筛选 为实现细胞在心包腔的精准递送与滞留，研究团队构建了由甲基丙烯酰化明胶（gelatin methacryloyl, GelMA）和甲基丙烯酰化丝素蛋白（silk fibroin methacryloyl, SilMA）组成的光敏性互穿网络（interpenetrating network, IPN）水凝胶。首先，研究人员将GelMA和SilMA分别溶解在含有0.25%光引发剂LAP的LI-APEL培养基中，制备10% GelMA和8% SilMA的预交联溶液。随后，将这两种溶液按1:1、1:2和2:1的体积比混合，并从多维度进行筛选。筛选标准包括：通过活/死染色（Live/Dead staining）评估生物相容性；使用流变仪（rheometer）在37°C下测量水凝胶和天然大鼠心脏组织的储能模量（G’）、损耗模量（G”）、剪切模量和损耗因子等力学性能，以寻找与心脏组织力学特性最为匹配的配方；通过扫描电子显微镜（SEM）观察冻干水凝胶的内部孔径结构；以及在II型胶原酶溶液中测试其体外降解速率。最终，基于其与心脏组织最接近的力学性能（高损耗因子、低剪切模量，呈现近流体粘性主导状态）和良好的生物相容性，选定GelMA与SilMA体积比为1:2（终浓度为3.3% w/v GelMA和5.3% w/v SilMA）的IPN水凝胶作为最终的细胞递送系统。
2. hESC-ECCs、hESC-CMs及hESC-ECs的定向分化 研究团队根据已发表的方案进行改良，从人胚胎干细胞（hESCs）分化获取ECCs、CMs及内皮细胞（endothelial cells, ECs）。对于hESC-ECCs，hESCs首先形成拟胚体（embryoid bodies, EBs），随后在化学成分明确的条件下，通过序贯添加rhBMP4、rhActivinA、rhbFGF等因子诱导其向中胚层分化，最后通过rhBMP10信号激活，在第9天左右分化为NKX2.5+CD31+的ECCs，并通过CD31微珠进行纯化，分化率约为50.2%。同时，也通过调节Wnt信号通路及后续的代谢纯化或VEGF信号激活，成功分化出hESC-CMs和CD31+NKX2.5-的hESC-ECs，用于后续的机制研究。
3. 细胞-水凝胶系统的体内外评价 将分选出的hESC-ECCs与预交联溶液混合，经405纳米紫外光固化形成载细胞水凝胶。通过共聚焦显微镜和SEM观察细胞在水凝胶中的形态与分布，并通过活/死染色评估其在体外培养3、14、28天后的存活情况。在体内研究中，将载细胞水凝胶植入小鼠皮下，于1、3、7、14天后取出，使用CellTiter试剂检测细胞存活率。同时，通过在小鼠背部皮下植入并定时称重，评估水凝胶的体内降解性能。此外，将荧光或染料标记的水凝胶注入大鼠心包腔，通过活体成像和开胸观察，验证其原位递送与驻留能力。并通过组织切片HE染色评估其对肝、脾、肺、肾和皮肤的组织安全性。
4. 大鼠MI模型构建与治疗效果评估 研究选用8-10周龄的SD大鼠，随机分为四组（每组6只）：假手术组、MI对照组、无细胞水凝胶注射组和hESC-ECCs治疗组。通过结扎左前降支（left anterior descending, LAD）冠状动脉构建MI模型。治疗组在结扎后，立即将含有约5×10⁵个hESC-ECCs的80微升预交联溶液注入心包腔，并用紫外光固化。术后2周和4周，利用Vevo 3100超声系统进行超声心动图（echocardiography, echo）检测，计算左心室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）和左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening, LVFS）。术后4周处死大鼠，取心脏进行组织学分析，通过Masson染色和HE染色评估纤维化面积，并利用免疫荧光染色（CD31和α-SMA）观察梗死区的毛细血管数量。
5. 治疗机制的体外探究 为探究hESC-ECCs的治疗机制，研究团队采用Transwell共培养体系，模拟细胞间的旁分泌作用。首先，将hESC-CMs与hESC-ECCs共培养后，用过氧化氢（H₂O₂）模拟氧化应激环境，通过CCK-8法检测CMs的存活率，并利用透射电子显微镜（TEM）观察CMs线粒体形态变化。其次，将hESC-ECs与hESC-ECCs共培养，通过细胞划痕实验评估EC的迁移能力，并通过管形成实验（tube formation assay）评估其血管生成能力，统计节点数、连接点数和总分支长度等指标。
四、主要研究结果
1. 递送系统性能优异 通过流变学筛选出的IPN水凝胶，其损耗模量和储能模量均低于100 Pa，呈现近流体状态。其剪切模量和振荡扭矩与天然大鼠心脏组织高度一致，且损耗因子最高，表明其具有出色的粘附性和柔顺性，能在心脏搏动时最小化形变产生的应力。该水凝胶在体内外均表现出良好的可降解性（体外28天降解约80%，体内14天降解90%）。SEM观察显示其内部为多孔网络结构，孔径分布扩展至250-300微米。活/死染色和CellTiter检测证实，该水凝胶对hESC-ECCs具有良好的生物相容性，细胞在体外培养28天后仍大量存活，且在体内植入一周后存活率超过35%。组织安全性实验显示，该水凝胶对主要脏器及皮肤无明显损伤。
2. hESC-ECCs治疗显著改善MI后心脏功能并减少纤维化 超声心动图数据显示，MI造模后2周，各手术组LVEF和LVFS均显著下降，确认模型成功。术后4周，hESC-ECCs治疗组的LVEF（64%±6.7%）和LVFS（39%±4.6%）相较于水凝胶对照组（39%±6.2%， 19%±3.4%）和MI对照组（38%±9.2%， 18%±4.9%）有显著提升。组织学分析结果与此一致，Masson染色显示治疗组的纤维化面积（12%±4.1%）显著小于水凝胶对照组（25%±6.7%）和MI对照组（23%±4.8%）。免疫荧光结果揭示，治疗组梗死区的毛细血管（CD31+/α-SMA-）数量明显多于对照组，提示hESC-ECCs能延缓MI后毛细血管的萎缩。
3. 治疗机制与抗氧化应激及促血管生成相关 体外机制研究揭示了两个关键作用通路。其一，在H₂O₂诱导的氧化应激下，与hESC-ECCs共培养的hESC-CMs存活率显著提高，约提升60%。TEM观察证实，共培养组CMs的线粒体形态保持正常，可见清晰的嵴结构，而对照组的线粒体则出现嵴消失和大量空泡化等典型损伤。这表明hESC-ECCs能通过保护线粒体来增强CMs的抗氧hESC-CMs化应激能力。其二，共培养实验结果证实了hESC-ECCs对内皮细胞功能的促进作用。细胞划痕实验显示，其能显著提升hESC-ECs的迁移率。管形成实验则表明，共培养组的内皮细胞形成的节点数、连接点数、总分支长度和主节段数均显著增加，预示着更强的血管生成（angiogenesis）能力。
五、研究结论与价值
本研究首次证实了hESC-ECCs作为一种新型细胞疗法在治疗心肌梗死方面的潜力。通过心包腔注射搭载hESC-ECCs的GelMA/SilMA IPN水凝胶，能够有效改善大鼠MI模型的心脏功能、减少心肌纤维化并维持梗死区毛细血管密度。其治疗机制可能与hESC-ECCs通过旁分泌作用保护心肌细胞线粒体以抵抗氧化应激损伤，以及促进心脏内皮细胞的迁移和血管生成有关。 该研究的科学价值在于，它不仅为MI细胞疗法提供了新的、具有明确发育生物学功能基础的候选细胞来源，而且初步阐明了其保护机制。其应用价值体现在，所开发的力学性能与心脏组织高度匹配、可快速原位固化的IPN水凝胶递送系统，结合创伤小、临床转化潜力大的心包腔注射方式，为心脏疾病的局部细胞治疗提供了创新且安全的递送策略。
六、研究亮点
七、研究局限
需要注意的是，本研究为早期临床前探索，尚存在一定局限性。例如，治疗评估仅在大鼠模型中完成，其临床转化意义不如缺血再灌注（ischemia-reperfusion）大动物模型。此外，hESC-ECCs的心脏保护分子通路、其在体内的免疫调节效应、以及移植细胞在体内的最终命运（迁移、分化及长期存留）等问题仍有待进一步系统阐明。