学术研究报告：基于荧光激活细胞分选（FACS）的Broccoli RNA适配体开发及其在活细胞成像中的应用

作者及发表信息
本研究由Weill Cornell Medical College药理系的Grigory S. Filonov、Jared D. Moon、Nina Svensen和Samie R. Jaffrey*团队完成，于2014年10月22日发表在*Journal of the American Chemical Society*（JACS）上，标题为“Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution”。

学术背景
研究领域为合成生物学与RNA成像技术。绿色荧光蛋白（GFP）的基因编码荧光特性已被广泛用于蛋白质标记，但RNA的实时成像仍面临挑战。此前开发的RNA适配体（如Spinach和Spinach2）可结合类GFP荧光团（如DFHBI）并激活其荧光，但存在依赖镁离子、折叠效率低、需要tRNA支架等问题。本研究旨在开发一种新型RNA适配体，通过结合荧光激活细胞分选（FACS）和定向进化技术，快速筛选出在活细胞中高效折叠且荧光信号强的RNA-荧光团复合物。

研究流程
1. SELEX-FACS联合筛选平台
- 初始SELEX筛选：使用包含52个随机核苷酸的RNA文库（约10^14个成员），通过6轮SELEX筛选结合DFHBI的RNA适配体。与传统SELEX不同，本研究在早期（第4-6轮）即终止筛选，保留文库多样性。
- FACS筛选：将RNA文库克隆至大肠杆菌表达载体，转化后通过FACS分选高荧光细胞。载体同时表达远红色荧光蛋白eqFP670作为内参，以校正细胞体积差异。分选后，通过平板成像和测序鉴定高荧光克隆（如29-1家族）。

1. 核心序列鉴定与截断优化

   • 通过截断分析发现29-1的56-nt核心序列（29-1-t2）仍保留荧光活性，但折叠效率较低（45% vs. 29-1的81%）。
     
   • 采用“定向进化”策略：对29-1-t2进行可控突变（每个核苷酸以特定概率替换为其他碱基），生成突变文库，再经3轮SELEX和FACS筛选，获得折叠效率提升的突变体（如29-1-3）。
     

2. Broccoli适配体的开发与表征

   • 通过组合突变，最终获得49-nt的Broccoli适配体。其特点包括：
     
     • 低镁依赖性：在无镁条件下保留61%荧光（Spinach2仅11%）；
       
     • 高热稳定性：熔解温度（Tm）为48°C（Spinach2为37°C）；
       
     • 无需tRNA支架：在哺乳动物细胞中可独立折叠。
       
   • 进一步开发二聚体Broccoli（dBroccoli），荧光强度提升近2倍。
     

3. 细胞验证

   • 大肠杆菌：Broccoli荧光强度比Spinach2高2倍，且镁补充对其影响较小。
     
   • 哺乳动物细胞：Broccoli在无镁培养基中即可成像，而Spinach2需额外添加5 mM MgSO₄。
     

主要结果
1. SELEX-FACS平台有效性：早期终止SELEX结合FACS筛选，成功从庞大文库中快速鉴定高荧光适配体（如29-1）。
2. 定向进化的关键作用：通过突变文库筛选，解决了29-1-t2折叠缺陷，获得高性能Broccoli。
3. Broccoli的优越性：
- 低镁依赖性和高热稳定性使其在活细胞中表现更优；
- 短序列（49 nt）和无需tRNA支架增强了应用灵活性；
- dBroccoli为RNA成像提供了更高信号强度的工具。

结论与价值
本研究提出了一种高效筛选荧光RNA适配体的方法，解决了传统SELEX依赖结合力而非荧光激活的局限性。Broccoli的开发为RNA实时成像、转录监测及RNA传感器设计提供了更优工具，其低镁依赖性和独立折叠特性尤其适用于生理条件下的细胞研究。

研究亮点
1. 方法创新：首次将SELEX与FACS联用，直接筛选基于荧光信号的RNA适配体。
2. Broccoli的特性：短序列、高稳定性、低镁需求，突破了Spinach2的技术瓶颈。
3. 应用潜力：dBroccoli的构建展示了模块化设计在增强荧光信号中的可行性。

其他价值
- 为RNA-小分子相互作用研究提供了新思路；
- 定向进化策略可推广至其他适配体优化。

（注：全文术语首次出现时标注英文，如“荧光激活细胞分选（FACS）”“定向进化（directed evolution）”。）