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霍乱弧菌基因组进化研究：刚果民主共和国2018-2024年霍乱暴发期间的CTX-φ原噬菌体重排
作者及机构：
Leonid M. Irenge等（比利时鲁汶大学应用分子技术中心、刚果民主共和国布卡武高等医学技术研究所）
发表期刊及时间：*Emerging Microbes & Infections*，2024年
学术背景
霍乱是由O1和O139血清型霍乱弧菌（*Vibrio cholerae*）引起的急性腹泻病，其致病性主要依赖CTX-φ噬菌体编码的霍乱毒素。近年来，撒哈拉以南非洲成为霍乱高发区，刚果民主共和国（DRC）贡献了全球5%-14%的病例。2018-2024年，DRC东部省份暴发多轮霍乱疫情，但此前对当地流行菌株的基因组演化机制缺乏系统研究。
本研究旨在通过全基因组测序和系统发育分析，揭示DRC霍乱弧菌的遗传进化特征，重点关注CTX-φ原噬菌体的重排现象及其与流行病学传播的关联。
研究流程与方法
1. 样本收集与表型分析
- 样本来源：从DRC四个省份（北基伍、南基伍、坦噶尼喀、东开赛）的霍乱患者中收集269例临床分离株，最终确认263株为O1血清型霍乱弧菌（97.8%）。
- 表型鉴定：通过碱性蛋白胨水培养、TCBS琼脂筛选及血清凝集试验（O1 Ogawa/Inaba）确认菌株；实时PCR检测*ompW*（外膜蛋白基因）和*ctxA*（霍乱毒素亚基基因）。
- 药敏试验：采用扩散法测定抗生素敏感性，发现所有菌株对氨苄西林、氯霉素和四环素敏感，但对复方新诺明和多黏菌素B耐药（符合El Tor生物型特征）。
2. 全基因组测序与生物信息学分析
- 测序平台：
- 短读长测序：Illumina MiSeq（2×300 bp），用于核心基因组SNP分析和CTX-φ基因拷贝数检测。
- 长读长测序：Oxford Nanopore GridION（24株代表性菌株），用于解析CTX-φ原噬菌体的复杂重排结构。
- 数据分析流程：
- 系统发育树构建：以参考基因组N16961为基准，使用SPAdes组装、Snippy检测SNP/Indel，Gubbins排除重组区域，FastTree生成进化树。
- CTX-φ噬菌体分析：通过Illumina数据映射和覆盖率归一化（以单拷贝基因*pntA*为基准），估算CTX-φ基因（如*rstR*、*ctxB*）的拷贝数；长读长数据用于定位原噬菌体在大小染色体上的整合位点。
3. 比较基因组与功能注释
- 核心基因组分析：鉴定Afr10d和Afr10e亚谱系的65个核心SNP差异。
- 毒力基因与耐药基因：通过VFDB和AMRFinderPlus数据库注释，发现所有菌株携带ICEVchBan5（介导磺胺耐药）和gyrA S83I/*parC S85L*突变（与喹诺酮类耐药相关）。
主要研究结果
1. 系统发育与流行病学关联
- 所有DRC菌株属于Afr10谱系（第三波大流行T10传播事件的后代），进一步分为Afr10d（ST515）和Afr10e（ST69）亚谱系。
- 地理分布：Afr10e在2020年后成为优势谱系，扩散至所有四省；Afr10d在2020年后近乎灭绝（仅剩零星病例）。东开赛省的菌株与东部大湖地区（GLR）菌株高度同源，提示疫情向西扩散的可能途径。
2. CTX-φ原噬菌体的动态重排
- 2018-2020年菌株：大染色体上携带经典CTX-φ-3原噬菌体（含RS1ca卫星噬菌体）。
- 2022年后菌株：出现显著重排：
- 大染色体：CTX-φ-3下游新增两个串联的RS1env-DRC环境卫星噬菌体（含非典型*rstC*突变）。
- 小染色体：2-4个环境型pre-CTX-φ原噬菌体串联插入（与亚洲非O1菌株O139 VC1374结构相似）。
- 2023年新变异：3株菌株完全缺失大染色体上的CTX-φ-3核心区，仅保留小染色体的pre-CTX-φ阵列。
3. 耐药性与毒力基因的保守性
- 所有菌株携带相同的耐药基因（如*sul2*、*catB9*）和毒力岛（VPI-1、VSP-II），但CTX-φ重排未影响毒素表达。
结论与意义
- 科学价值：首次揭示DRC霍乱弧菌CTX-φ原噬菌体的环境-临床杂交重排现象，表明噬菌体动态进化可能增强菌株适应性。
- 应用价值：为非洲霍乱疫情的分子溯源和传播链追踪提供基因组标记，提示需监测外来菌株（如亚洲O139）通过人类活动引入的风险。
- 新假说：气候变暖与跨境人口流动可能是驱动CTX-φ重组的关键因素。
研究亮点
- 创新方法：结合Illumina短读长（覆盖度分析）和Nanopore长读长（结构解析），精准刻画CTX-φ复杂重排。
- 重要发现：
- 发现环境来源的RS1env-DRC卫星噬菌体与临床菌株的杂交现象。
- 揭示小染色体上pre-CTX-φ阵列的多次复制，类似亚洲非O1菌株，提示跨大陆基因交流。
- 特殊对象：聚焦长期被忽视的DRC东部疫区，填补了非洲霍乱弧菌基因组演化的空白。
其他有价值内容
- 数据公开：测序数据已提交欧洲核苷酸档案库（ENA: PRJEB66194），促进后续研究。
- 伦理合规：研究获刚果伦理审查委员会批准（ISTM-Bukavu/CRPS/CIES/ML/0016/2023），样本匿名化处理。