主要作者与发表信息
本研究由成都中医药大学药学院药理系的曾九僧（Jiuseng Zeng）、唐宇（Yu Tang）及赵奥涛（Aotao Zhao）等学者共同完成，通讯作者为彭熙（Xi Peng）与曾南（Nan Zeng）。该成果发表于*Phytomedicine*期刊2026年第158卷，文章编号158411，于2026年6月8日在线发表。
学术背景
抑郁症是一种以显著且持久的快感缺失和情绪低落为核心临床特征的精神疾病。全球终生患病率已达11%，且仍在持续上升。现有抗抑郁疗法普遍存在起效延迟的问题，约三分之一的患者还会出现认知和运动功能障碍、代谢紊乱及睡眠障碍等不良反应。因此，寻找更有效且更安全的治疗选择具有重要的社会意义。
海马神经可塑性损伤是抑郁症发病的关键病理机制之一。慢性应激导致的高水平糖皮质激素通过激活糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor, GR）损害海马突触结构与功能，同时抑制新生神经元形成。另一方面，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）通过激活酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B, TrkB）/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）信号通路，在神经元增殖、分化及神经可塑性恢复中发挥关键作用。GR与PI3K/Akt信号通路之间可能存在交叉对话，阐明二者在慢性应激条件下的内在联系，可为抑郁症海马神经可塑性的分子机制提供新的见解。
柴当薄方（chaidangbo prescription, CDB）是本课题组前期通过对经典抗抑郁复方逍遥散进行拆方分析和均匀设计所获得的简化方，由当归、柴胡和薄荷组成，具有疏肝养血之功效。前期研究表明，CDB具有与逍遥散相当的抗抑郁效应。然而，其物质基础和作用机制尚不明确。本研究旨在明确柴当薄方乙酸乙酯部位（ethyl acetate fraction of chaidangbo prescription, EAFC）是否通过促进海马神经可塑性来缓解慢性应激诱导的小鼠抑郁表型，并重点阐明GR和TrkB/PI3K/Akt信号通路在其抗抑郁效应中的关键作用。
研究流程与实验方法
本研究采用了“体内动物实验—体外细胞实验—多组学与网络药理学预测—靶点通路验证”的整合研究策略，具体包括以下几个主要环节：
第一环节为EAFC的制备与质量控制。柴当薄方由柴胡、当归和薄荷按14.4:14.4:4.1的比例组成。药材经95%乙醇回流提取后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，冻干获得EAFC粉末，得率为1.45%。采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）对EAFC中的绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸、橙皮苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷b2六种成分进行定量分析。
第二环节为慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress, CUMS）模型的建立与行为学评价。选用90只雄性小鼠，随机分为对照组（15只）和造模组（75只）。造模组小鼠接受为期8周的CUMS方案，包括禁食、禁水、夜间照明、笼具摇晃、夹尾、噪声、冰水游泳、拥挤、醋刺激、湿垫料、无垫料、笼具倾斜、束缚和足底电击等多种应激源。第28天通过糖水偏好测试确认造模成功后，将CUMS小鼠随机分为5组（每组15只）：CUMS组、CUMS+氟西汀（fluoxetine, FLX, 13.2 mg/kg）组、CUMS+CDB（22.0 g/kg）组、CUMS+EAFC低剂量组（159.5 mg/kg）和CUMS+EAFC高剂量组（319.0 mg/kg）。从第5周起每日灌胃给药，持续4周，应激持续至治疗期结束。行为学测试依次包括糖水偏好测试、溅水测试、旷场测试、悬尾测试、强迫游泳测试和新奇抑制摄食测试。
第三环节为海马神经可塑性的形态学与电生理检测。采用高尔基-考克斯染色评估海马CA1区树突复杂性和树突棘密度；透射电子显微镜观察海马齿状回（dentate gyrus, DG）区突触囊泡数量；全细胞膜片钳记录DG神经元自发兴奋性突触后电流的振幅和频率；尼氏染色评估CA1、CA3和DG区神经元损伤；免疫荧光检测神经元核蛋白、裂解型caspase-3、双皮质素和5-溴-2′-脱氧尿苷的表达；Western blot检测突触相关蛋白synaptophysin和突触后密度蛋白95的表达。
第四环节为海马非靶向代谢组学分析。采用超高效液相色谱-质谱联用技术对对照组、CUMS组和EAFC组海马组织进行代谢谱分析，通过主成分分析、偏最小二乘判别分析、火山图和维恩图等多元统计方法筛选差异代谢物，并进行KEGG通路富集分析。
第五环节为EAFC入脑成分鉴定与网络药理学分析。对EAFC灌胃后的小鼠脑匀浆进行UPLC-MS/MS分析，鉴定入脑原型成分和代谢产物。基于鉴定到的34个入脑成分，利用TCMSP、OMIM、TTD、PharmGKB、NCBI和GeneCards等数据库预测其作用靶点，与抑郁症相关靶点取交集后构建蛋白-蛋白相互作用网络，进行GO和KEGG富集分析，并对核心靶点Akt1、GR和caspase-3进行分子对接验证。
第六环节为体外细胞实验验证。以皮质酮刺激的HT22小鼠海马神经元细胞系为体外模型。CCK-8法筛选皮质酮造模浓度和EAFC给药浓度；流式细胞术检测细胞凋亡；F-actin染色评估细胞骨架结构；Western blot检测TrkB/PI3K/Akt通路蛋白及GR磷酸化水平；免疫荧光观察GR核转位；免疫共沉淀检测Akt与GR的结合。利用Akt抑制剂MK-2206和TrkB抑制剂ANA-12进行机制干预实验，以区分Akt和TrkB在EAFC效应中的不同作用。
主要研究结果
HPLC分析显示，EAFC中阿魏酸含量为19.90 mg/g，柴胡皂苷a为32.20 mg/g，柴胡皂苷b2为42.06 mg/g，迷迭香酸为7.91 mg/g，橙皮苷为3.57 mg/g，绿原酸为1.62 mg/g。阿魏酸和柴胡皂苷a的含量均显著高于药典对原药材的最低限量要求，表明活性成分在EAFC中得到了有效富集。
行为学结果显示，CUMS小鼠表现出显著的糖水偏好降低、悬尾和强迫游泳不动时间增加、旷场中央区活动时间减少、溅水测试理毛时间缩短以及新奇抑制摄食潜伏期延长。EAFC给药4周后，上述抑郁样行为均得到显著逆转。值得注意的是，EAFC高剂量（319 mg/kg，相当于22 g/kg生药）的抗抑郁效应与22 g/kg的CDB原方煎剂相当，提示EAFC可能是CDB整体疗效的主要活性部位之一。
在神经可塑性方面，CUMS小鼠海马CA1区树突复杂性和树突棘密度显著降低，DG区突触囊泡数量减少，sEPSC振幅和频率均下降，突触蛋白synaptophysin和PSD95表达下调。EAFC治疗有效改善了这些缺陷。此外，CUMS导致CA1、CA3和DG区尼氏体平均光密度降低和神经元损伤增加，成熟神经元凋亡率升高，DG区DCX和BrdU阳性细胞数减少。EAFC治疗减轻了神经元凋亡，恢复了神经发生水平。
海马代谢组学分析鉴定出41个在对照组与CUMS组以及EAFC组与CUMS组比较中共同差异表达的代谢物。KEGG富集分析显示这些代谢物显著富集于mTOR信号通路、细胞凋亡和ABC转运蛋白等通路。EAFC给药部分逆转了CUMS诱导的代谢物改变，使海马代谢组更接近对照组。
脑匀浆质谱分析共鉴定出34个EAFC相关入脑成分，包括阿魏酸、迷迭香酸、柴胡皂苷a等原型化合物及肉桂酸、二氢咖啡酸、异香草醛等体内代谢物。网络药理学分析发现110个EAFC入脑成分与抑郁症治疗靶点的交集靶点，PPI网络显示Akt1、caspase-3和核受体亚家族3组C成员1为核心靶点。KEGG通路富集分析确定PI3K/Akt信号通路为关键通路。分子对接验证显示，肉桂酸、柴胡皂苷a、阿魏酸和迷迭香酸与Akt1的结合能均低于-6.3 kcal/mol，具有稳定的结合构象。
Western blot验证显示，CUMS显著抑制了海马TrkB/PI3K/Akt信号通路的活性，包括BDNF、磷酸化mTOR和磷酸化CREB水平的降低。EAFC治疗显著改善了这些应激诱导的损伤。同时，CUMS增加了海马p-GR（Ser211）/GR比值，升高了SGK-1和FKBP51的表达，表明GR激活和核信号传导增强；EAFC则抑制了这些异常。相关性分析显示，总GR水平与TrkB/PI3K/Akt信号通路各靶点的激活状态呈强正相关，而p-GR/GR比值与该通路呈强负相关，揭示了GR活性与TrkB/PI3K/Akt通路之间的密切关联。
体外实验表明，200 μM皮质酮使HT22细胞活力降低约50%，EAFC在75 μg/mL浓度下保护效果最佳。EAFC显著降低了皮质酮诱导的细胞凋亡率，减轻了F-actin细胞骨架的塌陷和微管结构破坏，提高了BDNF水平和突触蛋白表达。机制研究发现，MK-2206和ANA-12均能阻断EAFC对PI3K、Akt和CREB的激活以及对BDNF表达的上调，但只有ANA-12能降低TrkB磷酸化，证实TrkB是Akt的上游靶点。两种抑制剂均抵消了EAFC对细胞骨架损伤的保护作用和对突触蛋白及DCX表达的上调效应。
关键发现是：EAFC显著抑制了皮质酮诱导的p-GR（Ser211）/GR比值升高和GR核转位，该效应可被Akt抑制剂MK-2206阻断，但不被TrkB抑制剂ANA-12阻断。免疫共沉淀实验证实GR和p-GR（Ser211）均可与Akt发生物理结合。皮质酮刺激降低了p-GR与p-Akt以及GR与p-Akt之间的相互作用，而EAFC缓解了这种皮质酮诱导的结合破坏。这些结果表明，EAFC通过激活Akt增强Akt-GR结合，从而抑制GR激活及其核转位。
结论与意义
本研究得出以下结论：EAFC通过激活TrkB/PI3K/Akt信号轴增强海马神经可塑性，同时通过增加Akt-GR相互作用抑制GR核转位，从而缓解抑郁样行为并恢复神经可塑性。这一双重机制揭示了神经营养系统与糖皮质激素系统之间的新型协同整合模式。
本研究的科学价值在于：首次阐明了柴当薄方乙酸乙酯部位的物质基础和作用机制，明确了阿魏酸、迷迭香酸和柴胡皂苷a等成分为其主要活性成分；揭示了Akt在GR调控中的非经典作用——不仅作为神经营养信号通路的下游效应分子促进神经可塑性，还能通过直接与GR结合抑制其核转位，从而减轻糖皮质激素的负面效应。这一发现为理解神经营养系统与应激激素系统之间的交叉对话提供了新的分子机制证据。在应用价值方面，本研究为柴当薄方作为简化抗抑郁复方的开发提供了药效学和机制学依据，也为基于活性部位的中药复方现代化研究提供了范式。
研究亮点
本研究的亮点主要体现在三个方面：其一，采用“拆方简化—活性部位追踪—多组学预测—靶点验证”的研究策略，系统性地揭示了柴当薄方乙酸乙酯部位抗抑郁的物质基础和作用机制；其二，发现了EAFC通过Akt-GR蛋白相互作用调控GR核转位的新机制，这一发现超越了经典的GR磷酸化调控范式，为理解Akt与GR之间的非基因组交叉对话提供了直接证据；其三，通过体内CUMS模型与体外皮质酮刺激HT22细胞模型的结合，以及MK-2206和ANA-12两种抑制剂的选择性干预，清晰地区分了TrkB和Akt在EAFC效应中的不同作用层次，方法学上具有较好的严谨性和说服力。
其他有价值的发现
研究还发现，EAFC在有效剂量范围内未观察到明显的毒性反应、死亡或体重显著变化，提示其具有较好的安全性。此外，脑匀浆成分分析中鉴定到的34个入脑成分不仅包括原型化合物，还包括多种体内代谢产物，为后续进一步确定EAFC的真正药效物质提供了重要线索。代谢组学与网络药理学的整合分析策略也为中药复方机制研究提供了一种可借鉴的方法学路径。