作者为Andrei A. Golosov、Alec N. Flyer、Jakal Amin、Charles Babu、Christian Gampe、Jingzhou Li、Eugene Liu、Katsumasa Nakajima、David Nettleton、Tajesh J. Patel、Patrick C. Reid、Lihua Yang和Lauren G. Monovich，主要来自Novartis Institutes for Biomedical Research。该研究于2021年2月25日发表在Journal of Medicinal Chemistry上。
本研究属于药物化学与多肽药物设计领域。环肽作为治疗药物具有巨大潜力，但其被动细胞渗透性和口服暴露的实现一直是重大挑战。传统上，具有良好渗透性的环肽多为天然产物，而体外翻译等大规模文库技术虽能提供高度多样性的环肽配体，却缺乏对渗透性的选择压力。本研究旨在将计算设计策略与大规模文库兼容的氨基酸和硫醚闭环方式相结合，开发一类具有被动渗透性和口服暴露的新型硫醚环肽骨架，为后续发现针对多种蛋白靶标的可渗透肽配体奠定基础。
研究首先采用计算机模拟（in silico）方法对虚拟化合物库进行骨架N-甲基化模式的优化。研究者以6-mer环肽为起点，将C端半胱氨酸固定为甲基酰胺以限制氢键供体数量，N端氨基酸从苯丙氨酸的几种变体中选择，中间残基则选用正亮氨酸或其N-甲基化形式，并允许至多一个脯氨酸和不超过三个N-甲基化残基。由此产生10个同源系列、共292个虚拟6-mer肽。利用MacroModel进行低介电常数介质中的构象采样，并计算从水到膜的转移自由能ΔG_transfer和考虑构象系综的ΔG_transfer*，同时分析溶剂暴露的骨架NH数量。根据低ΔG_transfer*和零或极少暴露NH的标准，选择化合物进行固相合成。环化策略采用氯乙酰基N端封端与C端半胱氨酸侧链巯基的分子内亲核取代，形成硫醚键。随后，研究者将同样的计算筛选策略扩展至7-mer和8-mer，分别生成768和1514个虚拟序列。
对于合成的化合物，研究团队进行了系统的体外和体内表征。体外实验包括平行人工膜渗透性测定（PAMPA）、低外排转运体表达的Madin-Darby犬肾细胞（MDCK-LE）渗透性测定、实验极性表面积（EPSA）测定、Log D测定、水溶性和肝微粒体稳定性测试。体内实验则在大鼠和比格犬中进行药代动力学研究。对于代表性化合物1a，还利用核磁共振波谱（NMR）在氯仿中测定了其溶液构象，结果表明其计算构象（青色）与实验构象（绿色）高度重叠，四个分子内氢键（两个跨环、两个环外）使所有氢键供体均未暴露于溶剂。
6-mer系列的结果清楚展示了N-甲基化对渗透性的关键作用。未甲基化的母体化合物1的ΔG_transfer*为-4.30 kcal·mol⁻¹，有三个暴露的骨架NH，PAMPA渗透性低于检测限。而引入两个N-甲基的类似物1a和1b，其ΔG_transfer*分别降至-6.25和-5.44 kcal·mol⁻¹，暴露NH数均为零，PAMPA log Papp分别提升至-4.3和-4.3，MDCK-LE渗透性分别达到8.0×10⁻⁶ cm·s⁻¹和3.9×10⁻⁶ cm·s⁻¹。N-甲基化还显著降低了实验极性表面积（1a：69 Ų，1b：74 Ų，低于约80 Ų的经验阈值），并将Log D提高约0.5-1.0个单位。在大鼠药代动力学研究中，母体1口服暴露低于定量限，而1a和1b的全身Cmax分别达到114 nM和1028 nM，AUC分别为258 nM·h和2288 nM·h，口服生物利用度均为约20%。肝门静脉浓度分析表明其低口服吸收分数而非首过代谢是生物利用度的限制因素。尽管体外肝微粒体清除率极高，1a和1b的体内清除率分别为86和8.9 mL·min⁻¹·kg⁻¹，远低于肝血流速率，可能归因于高疏水性、高血浆蛋白结合和侧链代谢氧化受限。
7-mer系列进一步验证了该策略的可扩展性。在代表性同源系列中，未甲基化的8仅有2个暴露NH，但PAMPA渗透性差；含三个N-甲基的8b（ΔG_transfer=-4.12 kcal·mol⁻¹，零暴露NH）和8c（ΔG_transfer=-4.96 kcal·mol⁻¹，零暴露NH）则显示出优异的体外渗透性（PAMPA log Papp分别为-4.0和-4.4；MDCK-LE Papp分别为6.4×10⁻⁶和2.3×10⁻⁶ cm·s⁻¹）。值得注意的是，8b的分子量为913 g·mol⁻¹，8c为947 g·mol⁻¹。在大鼠中，8b和8c的口服生物利用度分别高达86%和84%。但在比格犬中，8b的口服生物利用度仅为3±2%，这可能是由于其强Caco-2外排比（>25）在低剂量下减少了吸收，而大鼠中使用的高10倍剂量可能饱和了外排转运体。
8-mer系列中，9a和10a-c的分子量均超过1000 g·mol⁻¹（1042-1076 g·mol⁻¹），计算Log P高达10-13。尽管这些化合物在MDCK-LE测定中均未显示可检测的A→B渗透性（回收率≥67%），且体外肝微粒体稳定性普遍较差，但在大鼠中仍实现了可测的口服暴露。10a的Cmax为411 nM，AUC为1269 nM·h，口服生物利用度为54%，清除率仅33 mL·min⁻¹·kg⁻¹。10b和10c虽然暴露较低，但证明了共享骨架和N-甲基化模式的侧链变体可扩展为化合物家族。10a的EPSA低于80 Ų，而10b和10c略高（85和86 Ų），提示在极端疏水性下，常规渗透性预测指标可能不再可靠。
本研究的核心结论是：基于三维物理的计算方法（ΔG_transfer*与溶剂暴露氢键供体数量）能够在化学合成前可靠地识别具有口服暴露潜力的环肽。传统的二维描述符如分子量、计算Log P和拓扑极性表面积单独或联合使用时，均无法准确预测大环的渗透性和口服暴露。而实验测定的Log D和EPSA能够提供更好的预测，但需要结合最低亲脂性要求。更关键的是，通过保留特定的骨架N-甲基化模式和硫醚闭环方式，可以构建与DNA或RNA模板合成等大规模阵列技术兼容的肽库。该研究的亮点在于：首次报道了口服可生物利用的含硫醚键大环肽；系统展示了N-甲基化位置对构象、分子内氢键网络和渗透性的决定性作用；证明“特权骨架”策略可将渗透性和口服暴露特性移植到侧链多样的类似物家族中。此外，研究还注意到部分高亲脂性大环如8b对CYP3A4有抑制作用，在治疗应用中需关注药物-药物相互作用风险。总体而言，该研究为可渗透环肽配体的发现提供了新的设计范式，并架起了计算设计与大规模文库筛选技术之间的桥梁。