一、 研究作者、机构与发表信息
本研究的主要作者是来自中国药科大学中药药理学系的吕琦、王凯、齐思淼、杨凌、辛益荣、戴月和魏志凤。其中，吕琦和王凯为共同第一作者，通讯作者为戴月和魏志凤。该项原创性研究成果以题为《Norisoboldine, a natural AHR agonist, promotes Treg differentiation and attenuates colitis via targeting glycolysis and subsequent NAD+/SIRT1/SUV39H1/H3K9me3 signaling pathway》的论文形式，于2018年发表在期刊*Cell Death and Disease*上，论文编号为9:258，采用开放获取模式。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于免疫药理学与自身免疫性疾病治疗领域，聚焦于溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis， UC）的发病机制及天然药物的干预作用。调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）是维持免疫耐受、防止自身免疫的关键CD4+ T细胞亚群，其功能缺陷与包括UC在内的多种自身免疫疾病的发生发展密切相关。因此，促进Treg细胞的分化与功能被认为是治疗此类疾病的有效策略。
背景知识方面，研究指出在UC状态下，结肠粘膜存在广泛的缺氧（Hypoxia）微环境。缺氧会导致microRNAs（miRs）表达谱的改变，并促使细胞代谢从氧化磷酸化转向糖酵解（Glycolysis）。已有证据表明，糖酵解的增强会抑制Treg细胞的分化。Norisoboldine（Nor，去甲异波尔定）是从中药乌药中分离的一种天然异喹啉生物碱，已被鉴定为芳烃受体（Aryl Hydrocarbon Receptor， AHR）的激动剂。前期研究发现，Nor能够有效缓解葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium， DSS）诱导的小鼠结肠炎，并且伴随结肠中Treg细胞比例的升高。然而，Nor在缺氧条件下促进Treg分化的详细分子机制尚不明确。
基于以上背景，本研究旨在深入探究Nor在缺氧微环境下促进Treg分化的机制，特别是从AHR/miRs轴和AHR/糖酵解轴的角度出发，并进一步阐明其下游信号通路如何最终介导Nor的抗UC作用。研究目标是绘制出Nor通过激活AHR、抑制糖酵解、调控表观遗传修饰，从而诱导Treg分化、缓解结肠炎的完整信号通路图。
三、 详细研究流程
本研究采用了从体外细胞模型到体内动物模型的系统性策略，流程清晰，逻辑递进。主要流程可概括为以下几个部分：
流程一：验证Nor在缺氧条件下促进Treg分化的效应及其AHR依赖性。 * 研究对象与处理： 从C57BL/6小鼠肠系膜淋巴结中分离纯化出初始CD4+ T细胞。在体外，使用抗CD3/CD28抗体刺激T细胞活化，并分别置于常氧（21% O₂）和缺氧（2% O₂）条件下培养。给予不同浓度的Nor（1, 3, 10, 30 µM）或经典的AHR激动剂TCDD（2,3,7,8-四氯二苯并二噁英， 5 nM）进行处理。 * 实验与方法： 1. 细胞活力检测： 使用MTT和CCK-8法评估Nor对CD4+ T细胞的细胞毒性，确保后续实验浓度无显著毒性（低于60 µM）。 2. Treg分化检测： 使用流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的频率。同时，通过Western Blot和qPCR检测Treg关键转录因子Foxp3及其分泌的抑炎细胞因子IL-10的表达水平。 3. AHR功能验证： 为证实AHR的参与，研究使用了特异性的AHR拮抗剂CH223191（10 µM）以及通过小干扰RNA（siAHR-3）敲低AHR表达。观察这些干预是否能阻断Nor对Treg分化的促进作用。 4. Nor激活AHR的直接证据： 通过液相色谱-质谱联用技术证实Nor能被CD4+ T细胞摄取。随后，通过免疫共沉淀检测Nor对AHR/HSP90复合物解离、AHR核转位以及AHR/ARNT复合物形成的影响。通过报告基因实验检测AHR下游的异生反应元件（Xenobiotic Response Element， XRE）的活性。并通过qPCR、Western Blot和酶活性测定检测AHR经典靶基因CYP1A1的表达和活性。 * 数据分析流程： 所有定量数据以均值±标准误表示，使用单因素方差分析进行统计学差异检验，P值小于0.05被认为具有显著性。
流程二：探究Nor促进Treg分化是否依赖于microRNAs（miRs）的调控。 * 研究对象与处理： 同样使用缺氧条件下的CD4+ T细胞，给予Nor或TCDD处理。 * 实验与方法： 通过qPCR检测先前报道与Treg分化相关的三个miRs（miR-31， miR-219， miR-490）的mRNA表达水平。为了验证miR-31的功能，向细胞中转染miR-31模拟物（mimic），然后观察其对Nor促Treg分化作用的影响。 * 数据分析： 比较处理组与对照组的miR表达量变化，并分析miR-31过表达后Treg细胞比例的变化。
流程三：探究Nor是否通过抑制糖酵解来促进Treg分化。 * 研究对象与处理： 缺氧或常氧条件下的CD4+ T细胞，经Nor或TCDD处理。 * 实验与方法： 1. 糖酵解通量评估： 使用荧光探针2-NBDG检测细胞对葡萄糖的摄取；使用试剂盒检测培养基中葡萄糖的消耗量和乳酸的产生量。 2. 糖酵解关键蛋白检测： 通过qPCR和Western Blot检测葡萄糖转运蛋白GLUT1以及一系列糖酵解关键酶（HK2， PFK， PKM等）的表达水平，重点关注Nor的抑制作用。 3. HK2功能回复实验： 构建并转染HK2过表达质粒，观察其能否逆转Nor对糖酵解的抑制以及对Treg分化的促进作用。 4. 上游机制探索： 检测Nor对缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白水平及其与ARNT形成复合物的影响。 5. 与AHR的关联： 使用AHR拮抗剂CH223191和siAHR-3，观察它们能否恢复Nor抑制的糖酵解过程。
流程四：揭示Nor抑制糖酵解后的下游信号通路。 * 研究对象与处理： 缺氧条件下的CD4+ T细胞，经Nor或TCDD处理，并联合使用HK2质粒、AHR拮抗剂或siAHR-3进行干预。 * 实验与方法： 1. NAD+水平检测： NAD+是糖酵解副产物和Sirtuins的底物。使用试剂盒检测细胞内NAD+水平。 2. SIRT1表达检测： 通过qPCR和Western Blot检测Sirtuin 1（SIRT1）的表达。 3. 组蛋白甲基转移酶筛选： 通过Western Blot筛选Nor对多种组蛋白甲基转移酶（如MLL1， G9a， SUV39H1）和去甲基化酶（如JMJD3， EZH2）蛋白水平的影响。发现SUV39H1显著下降。 4. SUV39H1降解机制研究： 通过qPCR检测其mRNA无变化，表明是转录后调控。使用蛋白合成抑制剂放线菌酮进行脉冲-追踪实验，证明Nor加速了SUV39H1蛋白的周转。使用蛋白酶体抑制剂MG-132，证明其降解依赖于泛素-蛋白酶体途径。并检测了Nor对SUV39H1多聚泛素化水平的影响。 5. 组蛋白修饰分析： SUV39H1主要催化组蛋白H3第9位赖氨酸的三甲基化（H3K9me3）。通过Western Blot检测全基因组H3K9me3水平。通过染色质免疫共沉淀技术，分析Foxp3基因启动子区及其关键保守非编码序列（CNS1， CNS2， CNS3）上H3K9me3的富集程度。为进一步精确定位，设计了覆盖Foxp3启动子不同区域的7对引物进行ChIP-qPCR。 6. 功能验证： 构建了Foxp3基因启动子野生型报告质粒和缺失特定区域（-1201至-1500）的突变体质粒，通过报告基因实验验证该区域H3K9me3修饰变化对Foxp3转录活性的影响。 7. 信号通路串联验证： 使用SIRT1特异性抑制剂EX-527，观察其对Nor下调SUV39H1和H3K9me3的影响，从而将SIRT1与下游表观遗传修饰联系起来。
流程五：体内验证Nor通过AHR/糖酵解/NAD+/SIRT1/SUV39H1/H3K9me3通路缓解结肠炎。 * 研究对象： 雌性C57BL/6小鼠，通过饮用2.5% DSS水7天、再换正常水3天，建立急性溃疡性结肠炎模型。 * 药物干预： Nor通过灌胃或直肠给药；TCDD腹腔注射；AHR拮抗剂CH223191腹腔注射；HK2过表达质粒与转染试剂混合后直肠给药。 * 评估指标与方法： 1. 疾病活动指数： 每日记录体重变化、粪便性状和便血情况，计算疾病活动指数。 2. 结肠宏观与微观病理： 测量结肠长度；结肠组织进行H&E染色，评估炎症程度、损伤范围和隐窝破坏，进行病理评分。 3. 炎症指标： 检测结肠组织中髓过氧化物酶（MPO）活性（中性粒细胞浸润标志）；通过qPCR和ELISA检测促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的水平。 4. 机制验证： 从结肠组织中检测：AHR激活标志（CYP1A1表达）、糖酵解相关蛋白（GLUT1， HK2）、NAD+水平、SIRT1、SUV39H1和H3K9me3的蛋白水平。通过流式细胞术分析肠系膜淋巴结和结肠固有层中Treg细胞的比例。检测结肠中Foxp3和IL-10的表达。 * 目的： 在体水平确认Nor介导的AHR激活、糖酵解抑制、NAD+/SIRT1/SUV39H1/H3K9me3信号调节、Treg细胞诱导以及结肠炎缓解之间的因果关系，证明CH223191和HK2质粒可以阻断Nor的这些效应。
四、 主要研究结果
Nor在缺氧条件下更强效地促进Treg分化，且依赖AHR激活。 实验结果证实，Nor在常氧和缺氧条件下均能促进CD4+ T细胞向Treg分化，且缺氧条件下的最低有效浓度更低（3 µM vs 10 µM），同等浓度下效应更强。AHR拮抗剂CH223191和敲低AHR（siAHR-3）完全阻断了Nor的促分化作用。机制上，Nor能被CD4+ T细胞摄取，并诱导经典的AHR激活事件：促使AHR/HSP90解离、AHR核转位、AHR/ARNT复合物形成，并增强XRE报告基因活性和CYP1A1表达。这确立了Nor在缺氧下通过AHR依赖性方式驱动Treg分化。
Nor促进Treg分化不依赖于miR-31的调控。 与一些经典AHR激动剂不同，Nor仅下调了miR-31的表达，而对miR-219和miR-490无影响。更重要的是，过表达miR-31模拟物并未影响Nor的促Treg分化作用，表明Nor的作用机制独立于这些miRs。
Nor通过抑制糖酵解促进Treg分化，其中HK2是关键靶点。 Nor显著抑制了缺氧CD4+ T细胞的葡萄糖摄取、消耗和乳酸产生，即抑制了糖酵解过程。在糖酵解相关蛋白中，Nor选择性地显著下调了GLUT1和HK2的表达，其中HK2的下调更为明显。过表达HK2质粒可逆转Nor对糖酵解的抑制，并几乎完全阻断其促Treg分化作用，证明HK2介导的糖酵解抑制是关键环节。AHR拮抗剂也能恢复Nor抑制的糖酵解，连接了AHR激活与糖酵解抑制。Nor抑制糖酵解的机制可能涉及抑制HIF-1α/ARNT复合物的形成，而非降低HIF-1α蛋白本身。
Nor通过抑制糖酵解，降低NAD+水平，进而下调SIRT1，促进SUV39H1蛋白降解。 Nor处理降低了细胞内的NAD+水平，这与其抑制糖酵解（乳酸脱氢酶反应可再生NAD+）一致。NAD+的减少伴随着其下游靶点SIRT1（一种依赖于NAD+的去乙酰化酶）表达的下调。SIRT1的下调并非通过直接去乙酰化Foxp3来影响其表达（因为Foxp3的mRNA和蛋白均升高），而是通过影响组蛋白修饰酶。在筛选的多个组蛋白修饰酶中，Nor特异性降低了SUV39H1的蛋白水平，但不影响其mRNA。进一步实验证明，Nor通过泛素-蛋白酶体途径加速了SUV39H1蛋白的降解。使用SIRT1抑制剂EX-527可以阻止Nor对SUV39H1的下调，从而将SIRT1与SUV39H1的稳定性联系起来。HK2过表达和AHR抑制也能恢复Nor降低的NAD+、SIRT1和SUV39H1水平，证明了该信号轴的连贯性。
Nor通过减少Foxp3启动子特定区域的H3K9me3修饰来促进其转录。 SUV39H1是催化H3K9me3（一种转录抑制标志）的主要酶。Nor处理降低了全基因组H3K9me3水平，并特别减少了Foxp3基因启动子区（尤其是-1201至-1500区域）的H3K9me3富集。报告基因实验证实，缺失该区域的Foxp3启动子对Nor的响应显著减弱。EX-527、HK2质粒和AHR抑制均能逆转Nor对该区域H3K9me3的抑制作用，将上游信号与最终的表观遗传调控节点相连。
体内实验证实Nor通过该通路缓解结肠炎。 在小鼠DSS结肠炎模型中，灌胃或直肠给予Nor均能有效缓解疾病症状（改善DAI评分、恢复结肠长度、减轻病理损伤、降低MPO活性和促炎因子），并增加结肠中Treg细胞比例。更重要的是，联合给予AHR拮抗剂CH223191或HK2过表达质粒，可以阻断Nor对上述疾病指标和Treg细胞的正面效应，同时也能逆转Nor对结肠组织中NAD+/SIRT1/SUV39H1/H3K9me3信号轴的调控作用。这强有力地证明了Nor在体内是通过“激活AHR → 抑制糖酵解/HK2 → 降低NAD+ → 下调SIRT1 → 促进SUV39H1降解 → 减少Foxp3启动子H3K9me3修饰 → 促进Foxp3转录和Treg分化 → 缓解结肠炎”这一完整通路发挥治疗作用的。
五、 结论与研究价值
本研究得出结论：天然AHR激动剂Norisoboldine，在溃疡性结肠炎的缺氧微环境下，通过调节AHR/糖酵解轴及其后续的NAD+/SIRT1/SUV39H1/H3K9me3信号通路，促进调节性T细胞的分化，从而发挥抗结肠炎作用。
其科学价值在于： 1. 系统阐明了Nor抗UC的新机制： 首次将AHR激活、细胞代谢重编程（糖酵解）、能量代谢物NAD+、表观遗传修饰（SIRT1去乙酰化酶活性和H3K9me3甲基化修饰）与Treg细胞命运决定有机地串联起来，绘制了一条清晰且完整的信号通路图，加深了对天然产物免疫调节机制的理解。 2. 揭示了缺氧微环境下免疫代谢与表观遗传的交叉对话： 研究强调了疾病局部微环境（缺氧）的重要性，并展示了Nor如何巧妙地利用这一环境，通过抑制缺氧增强的糖酵解来启动一系列有利于免疫耐受的级联反应。 3. 拓展了AHR激动剂的作用模式： 研究表明，不同于某些通过miRs起作用的AHR配体，Nor主要通过调控代谢和表观遗传来影响Treg分化，揭示了AHR信号通路的多样性。
其应用价值在于： 1. 为溃疡性结肠炎提供了新的潜在治疗策略和药物靶点： Nor本身作为一种天然化合物，显示出良好的治疗前景。同时，该研究提示AHR、HK2、SIRT1、SUV39H1等通路节点均可作为治疗UC的潜在干预靶点。 2. 为基于代谢和表观遗传调控的免疫疗法提供了理论依据： 研究证实了通过调节T细胞的代谢状态可以定向影响其分化命运，并通过表观遗传机制固定这种变化，这为开发针对自身免疫性疾病和癌症的免疫代谢疗法或表观免疫疗法提供了新思路。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的补充
研究还比较了Nor给药途径（口服与直肠给药）的效果，发现两种途径均有效，且原型药物即是其活性形式，这为其临床给药方式提供了参考。此外，研究将Nor与经典的（也是高毒性的）AHR激动剂TCDD在多个环节进行了平行比较，发现二者作用模式相似，这进一步佐证了Nor作为天然AHR激动剂的可靠性，并提示其可能具有更好的安全性前景。