本文属于类型a，现报告如下。
本研究由Jiefei Wang、Mingyue Cao、Lulu Han等为主要作者，通讯作者为Guangle Niu（北京理工大学化学与化工学院）、Bingyang Shi（河南大学-麦考瑞大学生物医学联合中心，现任职于悉尼科技大学）以及Ben Zhong Tang（香港中文大学（深圳）理工学院、香港科技大学）。该研究发表于《Journal of the American Chemical Society》，于2024年10月11日在线发表，卷号为146，页码28783–28794，文献DOI为10.1021/jacs.4c07785。
本研究的科学领域为化学生物学与肿瘤治疗学，具体聚焦于胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）的耐药性治疗、血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）穿透性荧光抗癌药物的设计及其诱导非凋亡性细胞死亡的机制。GBM是最常见且致死率最高的中枢神经系统肿瘤，中位生存期仅约14.6个月。当前一线化疗药物替莫唑胺（temozolomide，TMZ）通过诱导DNA异常甲基化引发细胞凋亡，但超过50%的患者对TMZ无响应，主要原因是胶质瘤细胞中DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的存在使细胞逃避凋亡。因此，亟需发展能够克服耐药性、高效穿透血脑屏障并具备肿瘤特异性的新型抗癌药物。细胞副凋亡（paraptosis）是一种新发现的非凋亡性程序性细胞死亡方式，其特征为内质网空泡化和/或线粒体肿胀及嵴结构破坏。靶向线粒体的副凋亡诱导剂可通过破坏肿瘤细胞的能量供应克服治疗耐药性，但现有副凋亡诱导剂普遍存在血脑屏障通透性差、线粒体靶向性不足及缺乏成像能力等缺陷。本研究旨在开发一类具有聚集诱导发光（aggregation-induced emission，AIE）特性的阳离子荧光抗癌药物，通过诱导副凋亡与铁死亡（ferroptosis）的协同作用，实现对耐药性GBM的高效治疗并同时实现活体成像示踪。
研究工作的具体流程可分为分子设计与合成、光物理性质表征、体外抗肿瘤活性与机制研究、体内成像与治疗评估四个主要阶段。首先，研究者基于四苯基乙烯（tetraphenylethylene，TPE）功能化的罗丹明类似物骨架，设计并合成了四种阳离子AIE分子，分别为Tripex-ClO4、Tripex-PF6、Tpex-ClO4和Tpex-PF6。通过核磁共振氢谱、碳谱、氟谱及高分辨质谱对中间体及最终产物进行了结构确认，并通过单晶X射线衍射进一步确认了C-Tripex、Tripex-ClO4、Tpex-ClO4和Tripex-PF6的晶体结构。光物理实验表明，这四种化合物在二甲基亚砜（DMSO）中荧光微弱，而在DMSO/甲苯混合溶剂中随着甲苯比例增加荧光显著增强，证实其AIE特性。固体状态下这些分子表现出深红至近红外发射，绝对量子产率最高接近7%。密度泛函理论（DFT）计算显示最高占据分子轨道（HOMO）主要离域于四苯基乙烯部分，而最低未占据分子轨道（LUMO）主要分布于氧杂蒽骨架，这种电子分离和扩展π共轭赋予其长波长发射特性，有利于活体成像。
在体外实验中，研究者首先在HeLa和U251-TR（TMZ耐药胶质瘤）细胞系中评价了四种AIE分子的细胞毒性。结果表明，所有分子均呈浓度依赖性毒性，其中Tripex-ClO4和Tripex-PF6因空间位阻较小而表现出更高的细胞杀伤活性。进一步选择这两种分子进行机制研究。共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）显示这两种AIE分子与线粒体绿色荧光探针MitoTracker Green（MTG）高度共定位，Pearson相关系数达到0.90–0.92，证明其优异的线粒体靶向能力。经AIE分子处理后，HeLa和U251-TR细胞出现明显的时间依赖性胞质空泡化，生物透射电子显微镜（bio-TEM）证实空泡来源于线粒体肿胀及嵴结构解体，而细胞膜保持完整，符合副凋亡的形态学特征。细胞毒性选择性实验表明，Tripex-ClO4和Tripex-PF6对五种正常细胞系毒性极低，而对包括胶质瘤干细胞在内的九种肿瘤细胞系具有显著杀伤作用，显示出良好的肿瘤选择性。
机制研究方面，研究者检测了活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、线粒体超氧化物、线粒体膜电位和脂质过氧化等指标。结果显示，两种AIE分子处理可诱导细胞内总ROS和线粒体超氧化物水平显著升高，线粒体膜电位明显下降，并增强脂质过氧化和细胞内不稳定铁水平，提示铁死亡通路被部分激活。通过使用凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK、坏死性凋亡抑制剂Nec-1、自噬抑制剂3-MA和铁死亡抑制剂Fer-1进行干预实验，发现仅Fer-1能够部分逆转AIE分子诱导的细胞死亡，证实其主要死亡方式为副凋亡并伴随弱铁死亡。Western blot和qRT-PCR分析表明，AIE分子处理后ALIX和GPX4蛋白表达下调，ATF4和p-JNK表达上调，而p38、ERK及CHOP等凋亡和内质网应激相关通路无明显变化。细胞内钙离子浓度显著升高，ATP水平下降，细胞周期被阻滞在G2/M期。综合以上结果，研究者提出了Tripex-ClO4和Tripex-PF6通过ATF4/JNK/ALIX调控的副凋亡和GPX4介导的铁死亡协同杀伤肿瘤细胞的分子机制。
在体内实验中，研究者首先建立了皮下HeLa荷瘤小鼠模型。通过尾静脉注射AIE分子后进行荧光成像，发现其在注射后4–6小时在肿瘤部位达到最大富集。经过5次尾静脉注射治疗后，肿瘤生长被显著抑制，Ki67免疫组化显示肿瘤细胞增殖能力明显下降。Western blot分析证实肿瘤组织中ALIX和GPX4下调、ATF4和p-JNK上调，与体外结果一致。更重要的是，在耐药性原位GBM小鼠模型（U251-TR）中，实时荧光成像显示Tripex-ClO4和Tripex-PF6能够有效穿透血脑屏障，在注射后4小时脑内荧光强度达到峰值。计算得到的正辛醇/水分配系数（cLog P）为7.03，表明其具有适宜的两亲性以穿过血脑屏障。经治疗后，U251-TR荷瘤小鼠的中位生存期从PBS组的18天和TMZ组的20天延长至40天（Tripex-ClO4组）和39天（Tripex-PF6组）。组织学分析显示治疗组肿瘤面积明显缩小，CD31表达降低、TUNEL阳性细胞增多，表明肿瘤血管破坏和细胞死亡增加。主要器官H&E染色及血液生化、血常规检查未发现明显异常，证明该治疗策略具有良好的生物安全性。
本研究的核心结论是：成功开发了首类能够穿透血脑屏障、靶向线粒体并诱导副凋亡与铁死亡协同作用的AIE荧光抗癌药物Tripex-ClO4和Tripex-PF6，为耐药性GBM的治疗提供了全新策略。其科学价值在于首次实现了金属-free副凋亡诱导剂在耐药性脑胶质瘤原位模型中的高效治疗，同时揭示了ATF4/JNK/ALIX和GPX4双通路协同调控的细胞死亡机制。应用价值在于这类分子兼具荧光成像和治疗功能，有望发展为脑部疾病的诊疗一体化药物，并为设计兼具血脑屏障穿透性和线粒体靶向性的荧光抗癌药物提供了分子设计范式。
本研究的亮点主要体现在以下方面：第一，首次报道了具有血脑屏障穿透能力的AIE型副凋亡诱导剂，解决了现有副凋亡诱导剂难以用于脑部肿瘤治疗的瓶颈；第二，通过精确调控分子空间位阻和反离子种类，实现了对肿瘤细胞的高选择性杀伤，而对正常细胞毒性极低；第三，将副凋亡与铁死亡两种非凋亡性细胞死亡方式协同激活，有效克服了TMZ耐药性；第四，利用AIE分子的近红外发射特性，实现了药物在活体内的实时荧光示踪和肿瘤靶向性评估；第五，在原位耐药GBM模型中实现了40天的生存期延长，显著优于TMZ的20天。此外，单晶结构分析和DFT计算为理解分子构效关系提供了重要依据，为后续药物优化提供了理论指导。