本项研究的主要作者是Sunny Sharma，Xinfu Jiao，Jun Yang，Kelvin Y. Kwan和Megerditch Kiledjian。研究团队来自美国罗格斯大学的细胞生物学与神经科学系。该项原创性研究成果发表在国际顶尖学术期刊 Nature Cell Biology 上，于2025年4月28日被接受，并于2025年在线发表，文章的具体识别信息为文章编号10.1038/s41556-025-01682-1。

在学术背景方面，这项研究主要属于RNA表观转录组学与细胞外囊泡生物学的交叉领域。近年来，RNA的化学修饰（如表观转录组修饰）在调控RNA稳定性、定位和功能方面的作用已被广泛认识，如m7G帽子、m6A甲基化等。此外，一系列非经典的5‘端帽子结构（如NAD、FAD、UDP-GlcNAc等）也陆续被发现。最近，糖基化作为一种新兴的RNA修饰开始进入研究者视野，特别是被称为“糖RNA”（glycoRNA）的小RNA被发现存在于细胞表面，但其功能意义尚不明确。与此同时，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles， EVs），尤其是外泌体（exosomes），作为细胞间通信的重要媒介，其内部装载的RNA种类和选择机制是当前研究的热点。本研究旨在探索糖基化修饰是否以及如何影响RNA的亚细胞定位和细胞间传输，特别是其在RNA靶向装载入外泌体过程中的潜在作用。因此，研究的目标是：1）在哺乳动物细胞中鉴定并表征一种新型的、由N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）衍生的糖RNA；2）明确这类糖RNA的亚细胞定位；3）探究其进入外泌体的机制及功能意义。

研究的具体工作流程包含多个精细的步骤。首先，在鉴定糖RNA阶段，研究者采用了代谢标记策略。他们使用了三种细胞可通透的糖衍生物探针：N-叠氮乙酰半乳糖胺-四乙酰化（ac4GalNAz）、N-叠氮乙酰甘露糖胺-四乙酰化（ac4ManNAz）和N-叠氮乙酰葡糖胺-四乙酰化（ac4GlcNAz），在HEK293T、HeLa和MCF7细胞系中进行标记。经过24-48小时孵育后，提取总RNA，并通过应变促进的叠氮-炔环加成点击化学（Strain-Promoted Azide-Alkyne Click Chemistry, SPAAC）将生物素共价连接到带有叠氮标记的RNA上。随后，通过琼脂糖凝胶电泳和近红外荧光成像（利用IRDye 800CW标记的链霉亲和素）进行可视化检测。结果显示，ac4GalNAz能有效标记出一类迁移速度较快的小RNA（glycoRNA），而ac4ManNAz仅能标记出微弱且迁移较慢的RNA条带，ac4GlcNAz则无信号。这表明细胞中存在一类特异的、由GalNAc途径衍生的糖RNA。进一步的实验证明，这类糖RNA对RNase A不敏感，但对RNase I和微球菌核酸酶（Micrococcal Nuclease）敏感，且不被DNase降解，证实了其RNA本质。此外，用能够去除UDP-GlcNAc帽子的酶spRai1处理，并未显著降低糖RNA信号，提示这种糖修饰可能并非位于5‘端，而是内部修饰。

其次，在鉴定糖RNA种类阶段，研究者从ac4GalNAz标记的HeLa和HEK293T细胞中分离小RNA（<200 nt），经SPAAC和链霉亲和素珠亲和纯化后，通过牛津纳米孔测序（Oxford Nanopore Sequencing）进行鉴定。由于纳米孔测序通常需要poly(A) RNA，研究者额外使用了E. coli poly(A)聚合酶对RNA进行加尾处理。测序结果揭示，这些糖RNA是一组多样化的非编码小RNA，包括小核仁RNA（snoRNA）、小核RNA（snRNA）、穹窿RNA（vault RNA）和Y RNA等多种亚型。通过Northern blot对Rny3和5S rRNA等代表性RNA的检测，进一步验证了测序结果的可靠性。分析显示，鉴定出的糖RNA种类与已知的外泌体RNA库有显著重叠，暗示其可能与外泌体相关。

第三，在明确糖RNA的亚细胞定位阶段，研究者采用了细胞分馏技术。他们将细胞核与总细胞质分离，并将细胞质进一步分离为可溶部分和膜结合细胞器部分。近红外荧光信号几乎完全出现在ac4GalNAz标记的总细胞质RNA中，而非细胞核RNA中。更重要的是，在细胞质内，糖RNA信号主要富集在膜结合组分，而非可溶组分。这提示糖RNA与膜结构或细胞器相关。为了直接验证其是否位于细胞外囊泡内，研究者从细胞培养上清中分离了细胞外囊泡和更纯的外泌体。使用两种商业化试剂盒：一种是分离直径约180 nm囊泡的“总外泌体分离试剂”，另一种是分离直径<110 nm外泌体的“PureExo”试剂盒。通过Western blot检测外泌体标志物CD9和对照蛋白GAPDH，并使用超分辨率随机光学重建显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）对分离的囊泡进行成像和粒径分析（平均直径52 nm），验证了外泌体分离的纯度。SPAAC分析显示，ac4GalNAz衍生的糖RNA几乎只存在于细胞外囊泡和外泌体组分中。对完整外泌体进行微球菌核酸酶处理不影响内部糖RNA信号，而用Triton X-100透化外泌体膜则能释放出糖RNA，这些实验共同证明糖RNA位于外泌体的腔内（intraluminal cargo），而非附着在表面。

第四，在研究外泌体糖RNA的释放通路阶段，研究者探索了外泌体生物发生对糖RNA的影响。外泌体形成涉及ESCRT（内吞体分选复合物）依赖和非依赖途径。他们使用了两种方法来抑制外泌体释放：一是利用小干扰RNA（dsiRNA）敲低ESCRT-0复合物的关键组分HGS（亦称Vps27）；二是使用药物抑制剂，包括抑制ESCRT依赖性途径的Manumycin A（MA）和抑制ESCRT非依赖性途径（通过抑制中性鞘磷脂酶2）的GW4869。实验结果显示，敲低HGS或用MA、GW4869处理细胞后，从细胞上清中分离得到的外泌体糖RNA信号显著降低。与此同时，在这些处理的细胞内部，细胞总RNA中的糖RNA信号则相应积累增加。这表明阻断外泌体的生物发生或释放，会导致其腔内糖RNA货物在细胞内滞留，反向证明了糖RNA是经由外泌体途径主动分泌的。

第五，在探究糖RNA的细胞间通信功能阶段，研究者进行了外泌体摄取实验。他们将ac4GalNAz标记的HeLa细胞来源的外泌体与未标记的“初始”HeLa细胞共培养。经过不同时间（1至20小时）孵育并彻底洗去游离外泌体后，提取初始细胞的总RNA进行SPAAC检测。结果发现，初始细胞内可以检测到糖RNA信号，且最早在1小时即可出现，持续长达20小时。为了确认信号来自内化的外泌体而非表面粘附，他们利用ac4GalNAz同样能标记外泌体表面糖蛋白的特性，通过DBCO-Cy5点击化学和活细胞共聚焦显微镜进行示踪。观察到外泌体在初期（1小时）既存在于细胞膜也出现于细胞内，而在后期则主要位于细胞内。这直接证明了外泌体可以将糖RNA作为功能货物传递给受体细胞。

第六，在探究糖基化修饰的生化基础及与蛋白质糖基化的关联阶段，研究者首先排除了已知的RNA糖基化位点acp3U的作用，因为敲低其修饰酶DTWD2或TSR3并不影响ac4GalNAz标记水平。接着，他们聚焦于GalNAc的代谢通路。敲低负责UDP-GlcNAc与UDP-GalNAc相互转化的半乳糖-4-差向异构酶（GALE），以及参与唾液酸合成通路的UDP-甘露糖-4-差向异构酶（GNE），均导致细胞内糖RNA标记信号的显著增强，表明细胞内的GalNAc稳态水平是决定糖RNA丰度的关键，且GalNAc是此类修饰的直接生化前体。竞争实验也证实，添加过量GalNAc可浓度依赖性地减少ac4GalNAz对糖RNA的标记。更有趣的是，当使用NGI-1（一种特异性且强效的寡糖转移酶Oligosaccharyltransferase, OST抑制剂）阻断蛋白质在内质网中的N-糖基化时，不仅细胞内的糖RNA标记减少，外泌体中的糖RNA也呈现剂量依赖性的降低。这表明蛋白质的糖基化与RNA的糖基化可能存在共调节关系，共享相同的糖供体池或调控通路，并且蛋白质糖基化可能影响了RNA向外泌体的靶向分选。

本研究得出的主要结论是：在哺乳动物细胞中，存在一类由N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）进行内部糖基化修饰的小非编码RNA。这类糖RNA具有独特的核酸酶抗性（尤其抗RNase A），主要定位并富集于外泌体的腔内。它们能够通过外泌体被有效地传递给邻近的初始细胞，从而实现细胞间RNA通信。外泌体的生物发生（包括ESCRT依赖和非依赖途径）对于糖RNA的释放至关重要。更重要的是，RNA的糖基化与蛋白质的糖基化在代谢和分选上存在调控联系，RNA的糖基化可能作为一种选择性信号，引导其被包装进入外泌体。

这项研究的科学价值与应用价值显著。在科学价值上，它首次系统地揭示了一类新型的、位于外泌体内的糖RNA，扩展了我们对表观转录组修饰多样性的认知，并将RNA修饰研究从细胞内环境延伸至细胞外囊泡介导的通信领域。它提出了“RNA糖基化作为外泌体货物分选信号”的新范式，为理解RNA如何被精确地分选至特定细胞外载体提供了全新视角。同时，发现了蛋白质与RNA糖基化之间可能存在交叉调控，这暗示细胞内可能存在一个协调大分子糖基化的更高级调控网络。在应用价值上，由于外泌体RNA（exRNA）是极具潜力的疾病生物标志物和治疗载体，糖RNA作为一种稳定且具有特异性分选信号的exRNA亚类，有望成为更灵敏、特异的诊断标志物。此外，理解糖基化如何控制RNA进入外泌体，可能为设计基于外泌体的RNA疗法提供新策略，例如通过工程化改造RNA的糖基化状态来调控其装载效率和靶向递送。

本研究的亮点突出。其重要发现在于鉴定并证实了外泌体腔内糖RNA的存在、细胞间转移能力及其与蛋白质糖基化通路的潜在偶联。研究方法的创新性体现在整合了代谢标记、点击化学、超分辨率显微成像、纳米孔长读长测序等多种前沿技术，特别是利用ac4GalNAz探针和SPAAC化学实现了对特定糖RNA群体的高特异性标记与追踪。研究对象的特殊性在于聚焦于外泌体这一热点领域内的新型RNA修饰，将两个快速发展的学科方向（RNA表观转录组学和细胞外囊泡学）有机结合，揭示了之前未被重视的生物学过程。

此外，研究还包含其他有价值的内容。例如，研究发现糖RNA在诱导多能干细胞（iPSCs）及其分化的诱导神经元（iNs）中呈现出不同的电泳迁移谱，提示糖RNA的组成或修饰模式可能具有细胞类型或分化状态特异性。同时，作者在讨论中对比了本研究发现的ac4GalNAz糖RNA与先前报道的ac4ManNAz细胞表面糖RNA，指出二者在迁移率、丰度、亚细胞定位（腔内vs.表面）上均存在差异，表明至少存在两类不同的糖RNA群体，丰富了该领域的认知。最后，作者还针对近期另一篇质疑ac4ManNAz标记糖RNA可能受到非RNA污染物干扰的研究，通过使用不同探针（ac4GalNAz）、展示其对特定核酸酶的敏感性以及不同的电泳迁移模式等多条证据，有力地支持了本研究中所鉴定糖RNA的真实性和可靠性。