本研究由 Shuqian Wan、Dorna Esrafilzadeh、Laura Poole-Warren、Kristopher Kilian 与 Ulises Aregueta Robles 等人完成，主要作者分别来自 新南威尔士大学（The University of New South Wales, UNSW） 的生物医学工程学院、Tyree Foundation Institute of Health Engineering、化学学院以及材料科学与工程学院。论文发表于 Journal of Materials Chemistry B，2026 年，第 14 卷，页码 6298–6310，DOI 为 10.1039/d5tb02475g。
运动神经元（motor neuron）的再生在神经组织工程中仍面临重大挑战，原因在于神经系统的细胞结构高度复杂，且其微环境处于动态变化之中。三维（3D）水凝胶（hydrogel）因其能模拟细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的物理与生化特性，被认为是构建体外神经组织模型的有力平台。层粘连蛋白（laminin, LN）是促进神经细胞黏附、神经突延伸与分化的重要 ECM 蛋白，然而在合成水凝胶中稳定整合层粘连蛋白存在成本高、影响结构稳定性等问题。
聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine, PLL）在二维（2D）培养体系中被广泛用于增强细胞黏附并促进层粘连蛋白的保留，但其在三维水凝胶中的应用受到限制。主要障碍包括：最佳剂量不明确、高浓度时产生细胞毒性、以及可能破坏水凝胶的溶胀行为与结构完整性。因此，如何在保持 PLL 生物活性的同时维持水凝胶网络的物理化学稳定性，是该领域亟待解决的问题。
本研究的目的是开发一种基于聚乙烯醇（poly(vinyl alcohol), PVA）甲基丙烯酸酯（PVA-MA）的稳定且具有生物活性的水凝胶体系，通过物理混合或共价接枝两种方式整合 PLL，并系统优化 PLL 的最低有效浓度，以支持运动神经元祖细胞（motor neuron progenitors, MNPs）的黏附、分化及早期神经网络形成，同时不损害水凝胶的结构稳定性。
本研究的整体流程可概括为四个主要环节：PLL 与 PVA 的甲基丙烯酸酯化修饰与表征、细胞相容性评价、水凝胶稳定性测试、以及运动神经元分化与形态计量分析。
首先，作者对 PLL（30–70 kDa）和 PVA（13–23 kDa，98% 水解）分别进行甲基丙烯酸酯化反应，使用 2-异氰酸乙基甲基丙烯酸酯（ICEMA）作为修饰试剂。PLL 的目标官能化程度约为 2%，PVA 的目标取代度约为每条链 7 个甲基丙烯酸酯基团。反应产物经透析纯化、冷冻干燥后，通过 ¹H NMR 谱图确认甲基丙烯酸酯基团的成功引入。PLL-MA 的 ¹H NMR 谱在 6.1 ppm 与 5.7 ppm 处出现乙烯基质子信号，证明双键已连接到 PLL 分子上。
其次，研究者根据 ISO 10993-5 标准，使用 L929 小鼠成纤维细胞进行细胞相容性筛选。受试物包括 PLL 和 PLL-MA，浓度分别为 0.2 wt%、0.02 wt% 和 0.002 wt%。通过台盼蓝排斥实验评估细胞膜完整性，并以 PVA-MA 为材料对照、乙醇为阳性毒性对照。结果显示，PLL 和 PLL-MA 在 0.02 wt% 及以上浓度均表现出显著细胞毒性，细胞活力降至 20% 以下。PLL 在 0.002 wt% 时仍呈现中度毒性（约 55% 活力），而 PLL-MA 在相同浓度下保持约 87% 的细胞活力，表现出更高的细胞相容性。据此，0.002 wt% 被选为后续水凝胶整合的浓度。同时，未修饰 PLL 在相同浓度下也被纳入测试，以考察物理混合方式对材料性能的影响。
第三，为比较 PLL 的物理整合与共价整合对水凝胶稳定性的影响，作者制备了三种水凝胶：PVA-MA 对照水凝胶、物理混合 PVA–PLL 水凝胶和共价交联 PVA–PLL 水凝胶。水凝胶由 15 wt% PVA-MA 大分子单体溶液在紫外光（320–395 nm，30 mW cm⁻²）照射 3 分钟聚合而成，光引发剂为 Irgacure 2959。通过质量损失（mass loss）和体积溶胀比（volumetric swelling ratio）评估水凝胶的聚合效率与结构稳定性。结果显示，共价 PVA–PLL 水凝胶在第一天质量损失与 PVA-MA 对照接近，物理混合 PVA–PLL 的质量损失约为对照的三倍，但所有组在 7 天内均低于 10%。各组水凝胶的溶胀比在第 1 天达到约 6，且无显著组间差异，说明低浓度 PLL 的加入并未显著改变水凝胶的交联网络和吸水能力。
第四，为了验证 PLL 整合水凝胶对层粘连蛋白的递送能力及对运动神经元分化的支持，作者将人胚胎干细胞 H9（hESCs-H9）分化为运动神经元祖细胞。分化方案遵循并改良自 Guo 等人 2017 年的流程。具体而言，hESCs-H9 在培养皿中形成运动神经元祖细胞球体（MNP spheroids），第 8 天解离为单细胞（MNP-d8），以 7.5 × 10⁴ cells/cm² 的密度接种于不同基底上。分化过程分为三个阶段：第 8–13 天加入视黄酸（retinoic acid, RA）、SAG、BDNF、GDNF 和 DAPT；第 13–15 天使用 BDNF、GDNF 和更高浓度 DAPT 诱导有丝分裂后分化；第 15–29 天添加 BDNF、GDNF 与 CNTF 促进神经元成熟。细胞培养基底包括：PVA-MA、物理混合 PVA–PLL、共价 PVA–PLL 水凝胶，并进一步分为层粘连蛋白包被与未包被组。对照组为 PLL 与层粘连蛋白联合包被的盖玻片。
细胞活力通过 Calcein-AM/碘化丙啶（propidium iodide, PI）活/死染色法评估，细胞覆盖面积使用 ImageJ 软件定量。神经元分化通过免疫荧光染色检测 Tuj1（神经元标志物）、Olig2（运动神经元祖细胞标志物）、HB9（有丝分裂后运动神经元标志物）和 MAP2（成熟神经元标志物）的表达。为定量评估细胞簇（cluster）和神经网络结构的形成，研究者设计了一套盲态问卷，由独立评估者根据簇的存在、数量、形状、大小、细胞数与簇间距等参数，对免疫染色图像进行打分。簇的定义为：至少 10 个神经元胞体围绕共同中心聚集，并具有放射状神经突向外生长。
在细胞相容性实验中，0.002 wt% PLL-MA 表现出可接受的细胞活力（约 87%），未修饰 PLL 在该浓度下仍存在一定毒性（约 55% 活力）。PVA-MA 本身未显示明显毒性，细胞形态正常。
在水凝胶稳定性方面，所有配方在 7 天内的质量损失均低于 10%，溶胀比稳定在约 6，说明低浓度 PLL 或 PLL-MA 不会显著削弱 PVA-MA 水凝胶的网络结构。物理混合与共价交联策略在低 PLL 含量下未表现出显著结构差异。
在细胞黏附与活力实验中，未修饰 PVA-MA 水凝胶几乎不支持细胞黏附，而物理混合与共价 PVA–PLL 水凝胶在无层粘连蛋白条件下即可支持较强的细胞附着。层粘连蛋白包被进一步增强了细胞铺展与神经突延伸。第 7 天时，共价 PVA–PLL + LN 的细胞覆盖面积达到 42.2%，接近盖玻片对照（49.1%），物理混合组为 36.3%。所有 PLL 或 PLL-MA 整合水凝胶的细胞活力维持在 65%–85%，与对照相当。
免疫染色结果显示，第 1 天所有组均表达 Tuj1、HB9 与 Olig2，提示运动神经元祖细胞处于未成熟状态。第 3 天，Olig2 表达减弱，HB9/Tuj1 信号增强，显示早期神经元分化。第 7 天，共价 PVA–PLL + LN 水凝胶上出现更显著的神经元簇与神经突网络，Olig2 表达进一步降低，Tuj1 与 HB9 表达增强，提示运动神经元趋于成熟。物理混合 PVA–PLL + LN 水凝胶也支持类似的形态学进程，但其网络复杂度略低于共价组。
簇形态计量分析显示，物理混合与共价 PVA–PLL + LN 水凝胶的簇出现率分别为 96.7% 和 93.3%，显著高于盖玻片对照（50%）。水凝胶上的簇形态更趋于球形，共价组球形率为 74%，物理组为 68.5%，对照组仅为 46.4%。共价 PVA–PLL + LN 水凝胶更易形成大而密集的簇（≥40 个细胞，占 43.3%），且簇间距更近（66.7% 的簇间距≤50 μm），而物理混合组则以低密度簇为主（<15 个细胞，占 54%）。盖玻片上的簇则呈现体积小、密度低、分布分散的特点。
本研究证明，在 PVA-MA 水凝胶中整合最低有效浓度（0.002 wt%）的 PLL，可以在不破坏水凝胶结构稳定性的前提下有效增强层粘连蛋白的保留，支持运动神经元祖细胞的黏附、分化及早期神经网络形成。物理混合与共价接枝两种策略在该浓度下均具有可行性，共价组在促进簇密度和网络连通性方面略具优势。
该研究的科学价值在于明确了 PLL 用于三维水凝胶的最低有效剂量，解决了以往高浓度 PLL 造成细胞毒性、破坏水凝胶溶胀行为的问题。其应用价值体现在为脊髓损伤和神经退行性疾病模型中的运动神经元再生提供了一种简单、可扩展且可调控的生物材料平台。此外，作者引入的基于问卷的簇形态计量分析，为客观评价体外神经网络结构提供了新工具，弥补了传统单一细胞形态与标志物分析的不足。
本研究的亮点包括：第一，首次在 PVA-MA 水凝胶体系中系统比较物理混合与共价交联两种 PLL 整合策略；第二，确立了 0.002 wt% 的最低有效 PLL 浓度，显著低于已有文献中常使用的 ≥0.01 wt% 至 1 wt% 的剂量；第三，创新性地将定量簇形态与网络结构分析纳入运动神经元分化评价体系；第四，所开发的 PVA/PLL 水凝胶可通过模具成型或制备管状结构，具备向周围神经修复与体外疾病模型转化的潜力。
该研究为神经组织工程中的生物材料设计提供了新的剂量参考与评价策略，强调了“最小化生物功能化即可实现生物学效能”的理念。