学术研究报告：基于TaqMan探针的多重实时荧光定量PCR技术在水产养殖弧菌病原检测中的应用开发

一、研究团队与发表信息
本研究由烟台大学海洋学院的Binzhe Zhang、Yulie Qiu、Chenxi Shi和Jian Zhang（通讯作者）团队完成，发表于2025年4月的期刊《Vet. Sci.》（2025年第12卷，327页），题为《Development of Multiple Real-Time Fluorescent Quantitative PCR for Vibrio Pathogen Detection in Aquaculture》。研究得到中国国家自然科学基金（U24A20463）和烟台大学研究生创新基金（GGIFYTU2340）支持。

二、学术背景与研究目标
弧菌病（Vibriosis）是由弧菌属（*Vibrio*）病原体引起的全球性水产养殖病害，导致严重的经济损失。其中，*Vibrio anguillarum*（VA）、*V. alginolyticus*（VAL）、*V. harveyi*（VH）和*V. scophthalmi*（VSC）是四种主要病原体。传统检测方法（如培养法和常规PCR）存在耗时长、灵敏度低、无法区分混合感染等问题。因此，本研究旨在开发一种基于TaqMan探针的多重实时荧光定量PCR（multiplex qPCR）方法，实现四种弧菌的高效、特异、灵敏检测，为水产病害早期防控提供技术支撑。

三、研究流程与方法
1. 实验设计与样本准备
- 菌株与样本：研究纳入63份人工感染的鱼类组织样本（肝脏、脾脏、肾脏混合匀浆）和42份环境样本（海水和沉积物），并添加8种非目标菌株（如*Edwardsiella piscicida*、*Photobacterium damselae*等）作为特异性对照。
- DNA提取：使用Tianamp细菌DNA试剂盒（Tiagen）和CTAB法分别提取细菌和临床样本DNA。

1. 靶基因选择与引物设计

   • 选择四种弧菌的特异性基因：VA的*empa*（编码锌金属蛋白酶）、VAL的*toxr*（毒力调控基因）、VH的*vhhp2*（外膜蛋白基因）和VSC的*luxr*（群体感应调控基因）。
     
   • 通过DNAMAN软件进行多序列比对，设计特异性引物和TaqMan探针（表1），并采用不同荧光标记（FAM、HEX、ROX、Cy5）区分信号。
     

2. 多重qPCR体系优化

   • 反应条件：通过梯度实验确定最佳引物浓度（0.2–0.4 μmol/L）、探针浓度（0.3–0.7 μmol/L）和退火温度（60°C）。
     
   • 标准质粒构建：将靶基因片段克隆至pMD-19T载体，构建重组质粒pVA、pVAL、pVH和pVSC，并计算拷贝数（2.59×10¹⁰–6.01×10¹⁰ copies/μL）。
     

3. 性能验证

   • 灵敏度：检测限为26–60 copies/反应，比常规PCR高100倍。
     
   • 特异性：仅靶标菌株出现阳性信号，无交叉反应。
     
   • 重复性：组内和组间变异系数（CV）均低于1.4%。
     

4. 临床与环境样本检测

   • 在63份临床样本中，成功检出单一感染（38.1%）、双重感染（28.57%）、三重感染（14.29%）和四重感染（4.76%），准确率100%。
     
   • 环境样本中，57.14%为单一阳性，14.29%为四重阳性。
     

四、主要研究结果
1. 高灵敏度与特异性
- 多重qPCR对四种弧菌的检测限低至10¹ copies/μL，且与常规PCR相比，灵敏度提升100倍（图5）。
- 特异性测试中，仅目标菌株的DNA被扩增（图4），其他病原体（如*Pseudomonas fluorescens*）无干扰。

1. 高效多重检测能力

   • 单次反应可同时检测四种病原体，耗时仅1小时，显著优于传统方法。
     
   • 标准曲线线性良好（R²>0.99），扩增效率（E）为96%–108%，符合MIQE指南要求。
     

2. 临床应用验证

   • 在混合感染样本中，该方法能准确区分不同弧菌组合（表4），为复杂感染诊断提供可靠工具。
     

五、研究结论与价值
1. 科学价值
- 首次建立同时检测四种水产弧菌的多重qPCR方法，填补了混合感染快速诊断的技术空白。
- 通过靶基因选择和探针设计，解决了弧菌属种间相似性高的鉴定难题。

1. 应用价值
   
   • 适用于养殖场、环境监测和海关检疫，助力弧菌病的早期预警和精准治疗。
     
   • 低成本、高通量的特点使其适合大规模筛查。
     

六、研究亮点
1. 技术创新：
- 整合多重PCR与TaqMan qPCR优势，实现“一管四检”。
- 自主研发的引物-探针组合具有专利潜力（如*empa*探针序列）。

1. 方法学严谨性：
   
   • 严格遵循动物实验伦理（烟台大学伦理批号20230503），数据重复性验证充分。
     

七、其他贡献
- 研究还提供了环境样本（海水/沉积物）的检测方案，扩展了技术应用场景。
- 补充材料中公开了引物序列和标准质粒构建流程（图S1），便于同行复现。

总结：该研究为水产弧菌病防控提供了高效分子工具，其方法学设计和技术参数可为其他病原体检测研究提供参考。未来可进一步开发便携式设备，推动该技术的现场应用。