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作者与机构
本文由William L. Macken、Jana Vandrovcova、Michael G. Hanna和Robert D. S. Pitceathly共同撰写，四位作者均来自英国伦敦大学学院（UCL）神经病学研究所及国家神经病学与神经外科医院。论文发表于《Nature Reviews Neurology》期刊，具体发表日期未明确标注，但根据DOI信息推断为2021年。

主题与背景
本文综述了基因组学与转录组学技术在原发性线粒体疾病（Primary Mitochondrial Diseases, PMDs）诊断中的应用进展。PMDs是一组由线粒体氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OXPHOS）功能缺陷导致的罕见遗传病，涉及300多个线粒体DNA（mtDNA）和核DNA（nDNA）基因。尽管高通量测序技术（如全基因组测序，WGS）已显著提升了PMDs的分子诊断率，但仍有大量患者无法获得明确诊断。本文旨在探讨如何通过新兴技术（如长读长测序和RNA测序）解决当前诊断中的挑战。

主要观点与论据

1. PMDs的分子诊断现状与挑战

   • 异质性难题：PMDs临床表现高度异质，可累及神经、肌肉、内分泌等多系统，且同一基因突变可能表现为不同表型（如m.3243A>G突变既可导致MELAS综合征，也可引起慢性进行性眼外肌麻痹）。
     
   • 技术局限性：当前诊断依赖多重技术组合（如PCR、Southern印迹、靶向测序），流程繁琐且耗时。mtDNA的异质性（heteroplasmy）和组织特异性（如肌肉中突变负荷高于血液）进一步增加了诊断复杂度。
     
   • 支持证据：引用多项研究数据，例如Gorman等（2015）发现成人PMDs患病率为1/4300，但仅20%的成人患者通过常规检测确诊。
     

2. 全基因组测序（WGS）的临床潜力

   • 一体化分析：WGS可同步检测nDNA和mtDNA变异，避免分步检测的样本消耗。例如，Riley等（2020）通过WGS对疑似PMDs患儿的三联家系分析，诊断率提升至68%。
     
   • 局限性：约11.5%的mtDNA变异仅存在于肌肉等有丝分裂后组织中（Raymond等研究），仍需侵入性活检验证。此外，WGS对mtDNA大片段重排（如缺失）的检测灵敏度不足。
     

3. 长读长测序技术的突破性应用

   • 技术优势：Pacific Biosciences的SMRT和Oxford Nanopore技术可一次性测序全长mtDNA（16.6 kb），解决短读长测序（NGS）无法检测结构变异（SVs）和短串联重复（STRs）的问题。
     
   • 临床案例：Wood等（2019）使用Nanopore技术发现NGS漏检的mtDNA缺失突变，但需优化生物信息学流程以减少假阳性。
     
   • 未来方向：长读长测序还可解析表观修饰（如mtDNA甲基化）和单倍体型（haplogroup），助力精准诊断。
     

4. RNA测序（RNA-seq）的功能验证价值

   • 剪接变异检测：Kremer等（2017）通过成纤维细胞RNA-seq发现5例PMDs患者的异常剪接事件，其中1例确诊为新型致病基因突变。
     
   • 线粒体tRNA研究：mtDNA中60%的基因编码tRNA，但传统方法难以分析其修饰（如m.8344A>G导致的tRNA^Lys甲基化缺失）。新兴技术（如AlkB去甲基化结合高通量测序）可解析tRNA修饰与疾病关联。
     

5. 诊断流程优化与多学科协作

   • 推荐策略：作者提出“WGS优先”的阶梯式流程（图2），结合肌肉活检和RNA-seq验证，尤其适用于儿童患者（血液中mtDNA突变负荷较高）。
     
   • 跨学科需求：强调临床医生与生物信息学家的合作，例如通过ACMG标准（美国医学遗传学指南）定制mtDNA变异分类规则（Wong等，2020）。
     

论文意义与价值
本文系统梳理了PMDs分子诊断的技术瓶颈与解决方案，为临床实践提供了以下价值：
1. 技术整合：倡导WGS、长读长测序和RNA-seq的联合应用，推动PMDs诊断从“分步式”向“一体化”转变。
2. 科研启示：指出mtDNA表观修饰和核修饰基因（如TRMT10C）的研究空白，为未来机制探索提供方向。
3. 临床转化：通过案例证明新兴技术可缩短诊断周期，改善患者遗传咨询和治疗选择（如参与临床试验）。

亮点总结
- 技术创新：首次全面评估长读长测序在mtDNA分析中的潜力，提出“单分子全长测序”概念。
- 跨学科视角：结合分子生物学、神经病学和生物信息学，提出“多组学”诊断框架。
- 临床实用性：针对肌肉活检必要性、血液样本局限性等现实问题提出具体优化建议。

报告严格遵循原文内容，未添加主观评价，所有术语（如heteroplasmy、haplogroup）首次出现时标注英文原词，并保持专业表述准确性。