本研究由Tadas Panavas、Cecily M. Hawkins、Zivile Panaviene和Peter D. Nagy共同完成，通讯作者为Peter D. Nagy，研究单位是美国肯塔基大学植物病理学系（Department of Plant Pathology, University of Kentucky）。该研究于2005年发表在病毒学领域期刊《Virology》第338卷第1期，页码为81至95。
该研究属于正链RNA病毒（plus-stranded RNA virus）复制机制领域，具体研究对象是黄瓜坏死病毒（Cucumber necrosis virus，CNV），该病毒属于番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）中的番茄丛矮病毒属（Tombusvirus）。正链RNA病毒的复制由病毒复制酶复合体（viral replicase complex）完成，该复合体必须与病毒RNA一起被靶向到细胞内膜系统，并在膜状囊泡或小球体（membranous vesicles/spherules）中进行复制。番茄丛矮病毒编码两个相互重叠的复制蛋白，即辅助蛋白p33和RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）p92。p33是一种RNA结合蛋白，含有富含精氨酸和脯氨酸的RNA结合基序（arginine and proline-rich RNA-binding motif，RPR基序），能够选择性结合病毒RNA中的保守茎环结构，即p33识别元件（p33 recognition element，p33re）。p33还包含p33:p33/p92相互作用结构域，可介导p33与p33之间以及p33与p92之间的相互作用。已有研究表明，p33:p33/p92相互作用结构域对番茄丛矮病毒复制是必需的，但p33和p92在细胞内如何被招募到复制位点，以及哪些结构域参与这一过程，此前尚不完全清楚。本研究旨在利用酵母（Saccharomyces cerevisiae）复制系统，系统分析p33和p92中已知功能结构域对细胞内定位和病毒RNA复制的影响，并探讨p33在招募病毒RNA和p92到过氧化物酶体膜（peroxisomal membrane）复制位点中的作用。
研究首先构建了荧光蛋白标记的p33和p92融合蛋白，以研究它们在酵母细胞中的亚细胞定位。结果显示，黄色荧光蛋白标记的p33（YFP-p33）与p92及DI-72复制子RNA共表达时，能够支持DI-72 RNA的高效复制，证明YFP-p33融合蛋白具有功能。共聚焦显微镜观察发现YFP-p33形成小的点状结构，位于细胞外周。进一步利用红色荧光蛋白（RFP）标记的酵母细胞器标志蛋白进行共定位分析，发现绿色荧光蛋白标记的p33（GFP-p33）与过氧化物酶体膜蛋白Pex3p和Pex13p共定位，而不与内质网、高尔基体、内体、脂质颗粒、线粒体等标志蛋白共定位，表明p33主要定位于过氧化物酶体来源的膜结构。随后，研究者构建了一系列p33缺失突变体，以确定影响p33定位和功能的结构域。删除N端70个氨基酸（p33Δ70）不影响p33在过氧化物酶体膜的定位，但使p33丧失支持DI-72 RNA复制的功能。删除N端100个氨基酸（p33Δ100）仍不影响p33定位，但删除N端150个氨基酸（p33Δ150）则破坏了p33在过氧化物酶体膜的定位，说明两个跨膜结构域（transmembrane domains，TMDs）对p33的正确定位是必需的。删除RPR RNA结合结构域（p33ΔRPR）不影响p33定位，但删除p33:p33/p92相互作用结构域中位点1（site 1，S1）的11个氨基酸（p33ΔS1）则改变了p33的定位，使其部分滞留于内质网，部分定位于过氧化物酶体膜。功能实验表明，p33Δ70、p33Δ100、p33Δ150、p33ΔRPR和p33ΔS1均不能支持DI-72 RNA复制。
对于p92蛋白，研究者构建了增强型黄色荧光蛋白标记的p92（YFP-p92）及其缺失突变体。YFP-p92与p33和DI-72 RNA共表达时能够支持DI-72 RNA复制，并定位于过氧化物酶体膜。与p33不同，删除N端70个氨基酸（p92Δ70）或100个氨基酸（p92Δ100）不影响p92定位，且这些突变体仍能支持DI-72 RNA约11%至17%的复制水平。删除150个氨基酸（p92Δ150）虽然去除了两个跨膜结构域，但并未完全阻止p92在过氧化物酶体膜的定位，且该突变体仍能支持部分DI-72 RNA复制。删除RPR RNA结合结构域（p92ΔRPR）不影响p92定位，并保留部分复制功能。然而，删除p33:p33/p92相互作用结构域中的位点1（p92ΔS1）改变了p92的亚细胞分布，使其部分滞留于内质网，部分定位于过氧化物酶体膜，且p92ΔS1几乎丧失复制功能，仅维持0.3%的复制水平。删除整个重叠区（pre-readthrough结构域）的p92C则完全丧失了在过氧化物酶体膜的定位，并且不能支持复制。
为了验证p33分子之间在酵母细胞内的直接相互作用，研究者采用了荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）分析和共纯化实验。FRET分析显示，仅当CFP-p33和YFP-p33在同一细胞中共表达时，才能检测到校正后的FRET信号，表明p33分子在活细胞内直接相互作用。共纯化实验进一步证实，GFP-p33能够与Flag标签的p33（p33Flag）共纯化，而单独的GFP不能与p33Flag共纯化，排除了GFP结构域导致非特异性结合的可能性。
为了研究病毒RNA在细胞内的定位，研究者将6拷贝的MS2噬菌体外壳蛋白（MS2 coat protein，MS2 CP）识别发夹结构插入DI-72 RNA中，构建了DI-72(+)/MS2，并利用YFP标记的MS2 CP来追踪该RNA在细胞内的分布。共表达CFP-p33、MS2 CP-YFP、p92和DI-72(+)/MS2后发现，在诱导后12小时，DI-72(+)/MS2 RNA与p33在过氧化物酶体中共定位；而在晚期时间点，大部分正链DI-72 RNA分散于细胞质中，p33仍保持过氧化物酶体分布模式。为了追踪负链复制中间体RNA，研究者构建了DI-72(−)/MS2，其中MS2 CP识别发夹以互补方向插入，因此只有复制产生的负链RNA才能结合YFP标记的MS2 CP。结果显示，负链RNA与p33在晚期时间点仍完全共定位，说明负链复制中间体主要存在于复制位点。此外，在缺乏p92的非复制系统中，研究者发现p33能够促进DI-72(+)/MS2 RNA向过氧化物酶体膜募集，而在缺乏p33的情况下，该RNA不能定位于过氧化物酶体膜，表明p33在病毒RNA向复制位点的募集中发挥重要作用。
综合以上结果，本研究得出以下结论：p33的N端跨膜结构域和p33:p33/p92相互作用结构域均影响p33在过氧化物酶体膜的靶向，而p92的跨膜结构域对其定位影响较小，p33:p33/p92相互作用结构域则对p92定位和复制功能具有重要作用。p33能够促进p92和病毒RNA向过氧化物酶体膜的募集，且p33、p92、正链病毒RNA和负链复制中间体RNA均定位于过氧化物酶体来源的点状结构，这些结构即为CNV复制的位点。FRET和共纯化实验证明p33分子之间存在直接相互作用。基于这些数据，作者提出一个模型：多个p33分子之间以及p33与p92之间通过p33:p33/p92相互作用结构域形成多分子复合物，p33特异性结合病毒RNA中的p33re元件，该复合物随后被靶向到过氧化物酶体膜，形成复制位点。p33作为“主调控因子”（master regulator），在番茄丛矮病毒复制过程中协调病毒蛋白和病毒RNA的靶向与组装，而p92中与p33相同的重叠序列在复制中发挥与p33不同的功能，这种策略增加了编码能力有限的番茄丛矮病毒的功能和调控步骤。
本研究的重点是揭示了p33:p33/p92相互作用结构域在p33和p92细胞内定位中的意外作用，证明p33通过形成多蛋白复合物协助p92和病毒RNA向过氧化物酶体膜复制位点的募集。研究还利用FRET技术和MS2 CP-RNA定位系统，在酵母活细胞内直接证明了p33分子间的相互作用以及病毒RNA与复制蛋白的共定位。此外，研究发现了负链RNA复制中间体与复制位点的紧密关联，以及正链RNA从复制复合体高效释放的现象，这些发现为理解正链RNA病毒复制复合体的组装和调控提供了新的见解。