本研究由Mansoura University兽医学院法医学与毒理学系的Ola Habotta和Benha University兽医学院法医学与毒理学系的Ahmed Abdeen担任通讯作者，联合多个研究机构完成，包括Mansoura University、New Mansoura University、Almaarefa University、Al-Baha University、Princess Nourah bint Abdulrahman University、University of Tabuk、Herat University、University of Kirkuk以及King Khalid University等。该研究于2025年发表于*Scientific Reports*期刊，论文题目为“Time-dependent expression of neural oxidative and inflammatory biomarkers in ischemic stroke using a transient MCAO rat model”，DOI为10.1038/s41598-025-08178-w。
缺血性卒中（ischemic stroke）是全球范围内导致残疾和死亡的主要原因之一，约占全球死亡人数的10%。该疾病由脑动脉闭塞引起的氧气和营养物质供应不足所导致，其发病机制涉及氧化应激（oxidative stress）、神经炎症（neuroinflammation）和自噬（autophagy）等多个病理过程。尽管目前已有多种诊断手段，但大多数方法主要用于排除神经或代谢性疾病，常规组织病理学检查在缺血早期阶段的诊断价值有限，尤其是当死亡发生于缺血后较短时间内时。因此，寻找可靠的生化标志物（biomarkers）对于缺血性卒中的早期评估、诊断和干预具有重要意义。
从法医学角度而言，生物标志物能够帮助确定缺血损伤发生的时间、持续时长及病理生理机制，为推断死亡原因和损伤时间提供依据。然而，既往研究对缺血时间与标志物表达变化之间的关系关注较少。基于此，本研究旨在利用大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型，系统探讨不同时间点（缺血再灌注后1、6、12、24和48小时）脑皮质中多种神经、氧化应激和炎症相关生物标志物的表达变化，以期筛选出可用于推定缺血后时间进程的可靠指标。
本研究采用成年雄性Wistar大鼠（平均体重200±10 g）作为实验对象，所有动物在受控环境中饲养，光照/黑暗周期为12小时，温度23±2°C，湿度50–60%。经过两周适应期后，采用经典Longa法建立短暂性局灶性脑缺血模型：以戊巴比妥（100 mg/kg腹腔注射）麻醉后，切开颈部腹侧，结扎颈外动脉并暂时夹闭颈总动脉，将3-0尼龙单丝线栓经颈内动脉插入至大脑中动脉起始部，阻断血流30分钟后拔出线栓以恢复再灌注。实验大鼠按再灌注时间分为五个亚组：1小时、6小时、12小时、24小时和48小时组。实验结束时以颈椎脱位法人道处死动物，取缺血侧脑组织进行后续分析。
氧化应激标志物检测：取脑组织匀浆上清液，分别检测丙二醛（malondialdehyde, MDA）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）和一氧化氮（nitric oxide, NO）水平。MDA采用硫代巴比妥酸反应物（TBARS）法在535 nm处测定吸光度；GSH采用Ellman法在412 nm处测定；NO通过Griess试剂测定亚硝酸盐生成量，在540 nm处记录吸光度。
促炎细胞因子检测：使用ELISA试剂盒（Elabscience, Texas, USA）检测脑组织匀浆上清液中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）水平，所有分析均做三个复孔，在450 nm处用Bio-Rad酶标仪读取吸光度，通过标准曲线计算浓度。
RNA提取与qRT-PCR：使用TRIzol试剂提取脑组织总RNA，经Nanodrop测定浓度后，利用cDNA合成试剂盒反转录为cDNA。使用SYBR Green PCR预混液进行实时荧光定量PCR，检测胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）、离子钙结合适配分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1, IBA-1）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）和Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）的mRNA相对表达水平，以β-actin为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算相对表达量。
组织病理学与免疫组织化学检查：脑组织经10%福尔马林固定、石蜡包埋、5 μm切片后进行苏木精-伊红（H&E）染色，光学显微镜下观察病理变化。免疫组化方面，切片经脱蜡水化、抗原修复、3% H₂O₂处理以灭活内源性过氧化物酶后，分别与LC3（ab192890）和p62（ab155686）一抗4°C孵育过夜，再与生物素化二抗和链霉亲和素过氧化物酶复合物孵育，DAB显色，苏木精复染，显微镜下观察并拍照。
统计分析：数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验，以P<0.05为差异有统计学意义。统计和绘图分别使用SPSS 13.0和GraphPad Prism 8.4.3软件完成。
氧化应激标志物的时间依赖性变化：与1小时组相比，脑组织GSH水平在缺血再灌注6小时后显著下降（P<0.05），12、24和48小时组GSH水平进一步降低，但12、24和48小时三组之间无显著差异。NO水平自1小时起即呈时间依赖性升高（P<0.05），48小时达到最高值。MDA水平在24小时和48小时组最高，两组之间无显著差异，但24小时组显著高于1小时和6小时组（P<0.05）；12小时与24小时组之间以及1小时与6小时组之间MDA水平差异不显著。这些结果表明，缺血再灌注损伤后脑组织抗氧化能力逐渐下降，而脂质过氧化和氮自由基生成随时间持续加剧。
炎症生物标志物的变化：TNF-α水平在缺血再灌注后随时间依赖性升高，至24小时达到峰值，随后在48小时组出现下降。IL-6水平呈现相似趋势，在6小时与12小时之间无显著差异。IL-1β水平则在48小时内持续升高（P<0.05），其中24小时和48小时组之间差异不显著。这些细胞因子的不同变化趋势可能与胶质细胞在不同时间点的激活和消退动态有关。
基因表达变化：GFAP、IBA-1和BDNF的mRNA表达均随缺血再灌注时间延长而显著上调（P<0.05），48小时组表达水平最高，依次高于24、12、6和1小时组。TLR4的表达模式则有所不同，24小时组表达最高，其次为12小时、6小时、48小时和1小时组。GFAP和IBA-1的上调反映了星形胶质细胞和小胶质细胞的活化增殖，而BDNF的升高可能代表机体启动内源性神经保护机制。
组织病理学发现：H&E染色显示，各时间点脑皮质切片均可见神经毡空泡化（vacuolations in the neuropil）、血管周围水肿（perivascular edema）和神经元皱缩（shrinkage of neurons），且这些病理改变随缺血再灌注时间延长而逐渐加重。
自噬相关蛋白表达：LC3免疫组化染色显示，阳性染色神经元数量随时间推移逐渐减少；而p62阳性神经元数量则呈现随时间逐渐增多的趋势。p62的累积和LC3的减少提示自噬流通畅性受损，自噬清除功能随缺血再灌注时间延长而逐渐下降。
本研究证明，在MCAO诱导的大鼠脑缺血再灌注损伤后，氧化应激标志物（GSH、MDA、NO）和炎症细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）呈现显著的时间依赖性变化，其中TNF-α和IL-1β可作为判断脑缺血时间的重要参考指标。GFAP、IBA-1、BDNF和TLR4基因在脑皮质区的表达随时间上调，与胶质细胞活化和神经保护反应相关。自噬相关蛋白LC3和p62的表达变化表明自噬功能障碍随缺血时间加重。
这些标志物的时间依赖性变化可作为“分子时钟”（molecular clock），在法医学调查中帮助确定卒中发生时间，尤其是当组织病理学表现不明确时。该研究为缺血性卒中后时间推断提供了实验依据，具有重要的法医学应用价值和临床参考意义。
本研究的突出特点在于系统性地在同一模型中同时考察了氧化应激、炎症、胶质细胞活化、神经营养因子和自噬相关标志物在多个时间点的动态变化，而非局限于单一类别或单一时间点。此外，研究采用雄性大鼠以排除雌激素对缺血损伤的保护性影响，提高了实验的可控性和结果的一致性。从法医学角度出发，研究强调标志物在推断缺血发生时间方面的潜在应用，这一视角在以往研究中较少被系统探讨。