反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）疗法通过结合RNA并调节蛋白质表达，被视为治疗神经系统疾病的一类很有前景的药物。然而，ASO难以穿越血脑屏障（blood-brain barrier, BBB），这一直是制约其临床应用的关键瓶颈。血脑屏障能够阻挡约98%的分子进入中枢神经系统（central nervous system, CNS），在维持脑内微环境稳定的同时，也将大多数药物排斥在外。由于寡核苷酸在大小、电荷和骨架化学等方面的生物物理性质，它们会被迅速从体循环中清除，并且无法高效穿过血脑屏障。因此，临床上常需要通过鞘内注射（intrathecal injection）或脑室内注射将药物直接递送到脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）中。但这种方法存在明显缺陷，例如药物在深部脑区浓度较低、在腰段脊髓浓度较高，可能引起安全性问题，同时还伴随鞘内给药相关的剂量限制或研究中断风险。因此，开发能够通过静脉或皮下给药并有效跨越血脑屏障的递送技术，已成为ASO治疗领域的重要方向。
在这一背景下，Denali Therapeutics于2024年8月14日在《Science Translational Medicine》上发表了题为“Targeting the transferrin receptor to transport antisense oligonucleotides across the mammalian blood-brain barrier”的研究。该研究由Barker SJ、Thayer MB、Kim C等作者完成，通讯作者包括Denali的多位核心研究人员，如Watts RJ、Lewcock JW和DeVos SL等。研究团队来自Denali Therapeutics等机构。该研究报道了一种工程化的人类转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1, TfR1）结合分子，称为寡核苷酸转运载体（oligonucleotide transport vehicle, OTV），可以将ASO递送穿过血脑屏障并进入小鼠和非人灵长类动物的大脑。
该研究的核心目的在于验证OTV是否能够有效携带ASO跨越血脑屏障，并实现中枢神经系统内广泛且持续的靶基因敲低。研究团队选择了在几乎所有CNS细胞类型中都表达的MALAT1基因作为靶标，将靶向MALAT1的ASO与OTV结合，通过静脉注射给药。结果显示，OTV不仅成功跨越血脑屏障，还在多个CNS区域以及内皮细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞等主要细胞类型中产生了累积性和持续性的基因表达敲低效应。此外，OTV还实现了在小鼠股四头肌和心肌中的基因敲低，而这些组织过去一直难以通过寡核苷酸实现有效递送。Denali首席科学官Joe Lewcock博士指出，该平台不仅能实现脑部摄取，还能进入细胞内并敲低目标基因，证明这一技术对该类药物同样有效。
研究还将OTV与当前领域内两种替代递送策略进行了直接比较：一种是将ASO与高亲和力、双价抗人TfR1抗体偶联，另一种是鞘内注射裸ASO。结果表明，OTV在整个CNS中的ASO分布比这两种策略都更广泛。高亲和力双价抗体虽然也能结合脑部血管上的TfR1，但无法有效穿过血脑屏障进入脑实质，这进一步凸显了OTV在转胞吞（transcytosis）方面的独特性质。该研究也指出了一些局限性，例如未来需要进一步研究剂量浓度和给药频率变化的影响，OTV在蛋白质结构、ASO序列、化学修饰以及其他RNA靶标方面的模块化程度仍需深入理解。此外，由于ASO的毒性特征具有序列依赖性，未来在治疗性寡核苷酸的OTV研究中，还需要评估ASO在外周清除器官如肝脏和肾脏中的沉积安全性，以及整个OTV复合物的安全性。研究作者还建议未来探索改善CNS靶向的策略。
从技术原理上看，Denali的转运载体技术基于工程化Fc结构域，即抗体的尾部区域。这些Fc结构域能够与特定天然转运受体如转铁蛋白受体结合。转铁蛋白受体在血脑屏障上表达，可以通过转胞吞作用将转运载体及其所携带的治疗分子运送到脑内。研究团队利用组合蛋白工程技术构建了包含数百万种蛋白变体的文库，每个变体在Fc结构域中具有略有不同的氨基酸残基组合。随后，他们通过定向进化（directed evolution）筛选出能够与转铁蛋白受体结合的变体，并进一步优化其结合亲和力等特性。该转运载体曾与靶向β-分泌酶1（β-secretase 1, BACE1）的抗体偶联，在阿尔茨海默病模型小鼠和猴中成功跨越血脑屏障并降低脑内淀粉样蛋白水平。Denali首席执行官Ryan Watts指出，特异性对于确保高效CNS靶向是必要的，但同时也必须具有足够的活性以递送有效剂量，并且必须避免由抗体融合引起的Fc介导免疫反应，例如抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity）。大约十年前，Watts及其同事曾报道靶向TfR1和BACE1的双特异性抗体会导致小鼠未成熟红细胞数量减少和溶血迹象，但经过工程改造以避免免疫效应的抗体则不会引起相同问题。此外，抗体片段与受体的结合强度也会影响其适用性，相对较低的TfR1亲和力可能更有利于CNS摄取，因为高亲和力TfR1抗体可能过度紧密地附着在脑内皮细胞上，从而无法进行转胞吞作用。
除了Denali，其他多家公司和研究团队也在探索利用转铁蛋白受体跨越血脑屏障的技术。罗氏（Roche）利用其抗体工程平台创建了能够结合脑内皮细胞上转铁蛋白受体的抗体，并以“Brain Shuttle”为品牌，这项技术不仅可以递送抗体，还可以用于将其他大分子药物递送到脑内。单域抗体特别是纳米抗体（nanobody）作为跨越血脑屏障的潜在载体也显示出良好前景。一种靶向小鼠转铁蛋白受体的纳米抗体与神经降压素融合后，通过受体介导的转胞吞作用实现了血脑屏障转运。纳米抗体具有高亲和力、高特异性、良好的生物分布以及易于工程化改造等优点。Ablynx公司（现属赛诺菲）创建的纳米抗体技术平台使用来自羊驼、 alpaca等物种的仅含重链肽（VHH）的抗体，这些重链纳米抗体的大小约为常规抗体的十分之一，可以通过多种途径跨越血脑屏障。
多肽因其易于获得和表征也被视为潜在的转运载体。英国公司Bicycle Therapeutics开发了一种药物递送系统，利用TfR1将RNA治疗药物转运穿过血脑屏障。该公司使用一种围绕中心化学支架约束的短合成双环肽，该肽能够结合TfR1。Bicycle Therapeutics已与Ionis Pharmaceuticals达成协议，授权使用TfR1结合物将寡核苷酸载荷递送到表达TfR1的组织，包括肌肉和脑组织。
除了利用TfR1受体跨越血脑屏障，Dyne Therapeutics的FORCE平台也被设计用于克服寡核苷酸递送的局限性。该平台使用Dyne专有的抗原结合片段（antigen-binding fragments, Fabs），这些片段能够结合在肌肉细胞上高表达的TfR1受体，从而实现向骨骼肌、心肌和平滑肌的靶向递送。抗TfR1 Fab通过可切割的缬氨酸-瓜氨酸连接子与具有gapmer化学结构的ASO偶联。治疗载荷也可以是ASO、磷酸二酰胺吗啉代寡聚物（phosphorodiamidate morpholino oligomers, PMO）、siRNA或小分子。该公司表示，该平台可实现向肌肉组织的靶向递送、延长给药间隔、支持重复给药，并能够针对1型强直性肌营养不良的遗传基础进行干预，以阻止或逆转疾病进展。
在临床研究方面，Denali也在利用TfR进行其主要候选药物DNL310的开发。DNL310是一种重组艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（iduronate 2-sulfatase, IDS），该酶与酶转运载体（enzyme transport vehicle, ETV）结合并被转运到细胞内，用于治疗亨特综合征（Hunter syndrome）。亨特综合征由IDS酶基因突变引起。DNL310目前已进入3期临床试验，在1/2期试验中，13名亨特综合征患者在两年治疗后的神经丝轻链（neurofilament light chain）水平较基线平均降低64%，神经丝轻链是神经元损伤的标志物。DNL310被认为是利用转铁蛋白跨越血脑屏障的最先进疗法之一，Denali计划申请加速批准。此外，Denali还在开发两个用于阿尔茨海默病和帕金森病的OTV候选药物。日本公司JCR Pharmaceuticals也在采用类似方法治疗亨特综合征，其药物Izcargo已在日本获批。Izcargo是一种抗TfR1双价抗体，通过TfR1驱动的受体介导转胞吞作用将IDS递送入脑。在2/3期试验中，25名患者中有21名神经认知状态得到改善或维持。
目前，唯一获得FDA批准的可成功跨越血脑屏障的基因疗法是Zolgensma，一种用于婴儿脊髓性肌萎缩症的药物。不过，除了基于TfR的方法之外，其他递送策略也在研究中。Voyager Therapeutics正在开发旨在穿越血脑屏障的腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）衣壳，其首席执行官Al Sandrock认为这些衣壳将比天然存在的AAV9血清型更高效。该公司发现，通过改变AAV衣壳表面，可以更有效地跨越血脑屏障，从而提高安全性和有效性。此外，利用受体介导配体内化以实现跨血脑屏障运输的新型研究也在进行中。许多受体，包括胰岛素受体、叶酸受体、脂蛋白受体、瘦素受体、白喉毒素受体、烟碱型乙酰胆碱受体、整合素受体、清道夫受体和白细胞介素受体等，都可以促进配体偶联纳米载体穿过血脑屏障。因此，多种配体偶联的受体介导药物递送系统已被用于治疗各种脑部疾病。
寻找能够将药物递送穿过血脑屏障的方法，不仅能提高寡核苷酸疗法的安全性，还能改善治疗结局。利用转铁蛋白受体的平台，如罗氏的Brain Shuttle、Dyne Therapeutics的FORCE平台、VHH纳米抗体、Denali的转运载体以及Bicycle Therapeutics的技术，以及超越TfR的多种其他方法，均显示出良好的发展前景。随着这些科学探索的不断推进，ASO药物递送有望迎来创伤更小、疗效更优的未来。