本研究由Poliana Gomes da Silva（巴西累西腓Aggeu Magalhães研究所病毒学系）、Aventino H. Fonseca（巴西迪亚曼蒂纳联邦大学药学系）、Malu P. Ribeiro、Taizia D. Silva、Cristiane F. F. Grael、Lindomar J. Pena、Tania M. S. Silva（巴西伯南布哥联邦农村大学化学系）以及通讯作者Eduardo de Jesus Oliveira（巴西迪亚曼蒂纳联邦大学药学系）共同完成。论文于2021年9月15日发表在Frontiers in Pharmacology期刊上，属于民族药理学（ethnopharmacology）领域的原创研究。该研究旨在从巴西特有药用植物Cissampelos sympodialis（锡生藤属）中寻找具有抗寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）活性的双苄基异喹啉类生物碱（bisbenzylisoquinoline alkaloids），并通过生物测定导向的分级分离策略（bioassay-guided fractionation）系统筛选和评价活性成分。

研究背景方面，寨卡病毒自2015年在巴西大规模暴发并与新生儿小头畸形（microcephaly）建立病因学关联以来，已成为全球公共卫生的重大关切。然而目前尚无有效的疫苗或药物可用于寨卡病毒感染的预防和治疗，因此寻找新型抗病毒先导化合物具有紧迫性。Cissampelos sympodialis是巴西特有的药用植物，其叶片和根皮热水浸液在民间和传统医学中广泛用于治疗支气管炎和哮喘。该植物富含双苄基异喹啉类生物碱，主要成分包括warifteine和methylwarifteine。已有文献报道双苄基异喹啉类生物碱具有抗HIV-1、抗单纯疱疹病毒和抗流感病毒活性，且该研究团队此前已发现C. sympodialis生物碱对登革病毒血清型II具有抗病毒活性。由于登革病毒与寨卡病毒同属黄病毒科（Flaviviridae），在分子和结构上具有诸多相似性，因此研究团队推测这些生物碱可能同样对寨卡病毒具有抑制作用，遂开展了本研究。

在详细工作流程方面，研究可分为六个主要步骤。第一步是植物材料准备与总叔胺生物碱组分（tertiary alkaloidal fraction of the rhizomes, TAFRZ）的制备。研究使用来自巴西帕拉伊巴联邦大学生物技术中心药用植物园的C. sympodialis栽培植株的根茎（rhizomes）1.6 kg，用70%乙醇（经氢氧化铵碱化至pH 10）进行提取，得到111 g粗乙醇提取物（EtOHRZ），然后通过常规酸碱萃取法分离获得15.8 g TAFRZ。第二步是高效液相色谱（HPLC）分级分离，采用制备型反相C18色谱柱（250 × 20 mm），以水和甲醇（均经氢氧化铵碱化至pH 8.0）为流动相进行梯度洗脱，流速12 ml/min，检测波长278 nm。该方法共收集到6个亚组分（subfractions），其中亚组分5经核磁共振氢谱和高分辨质谱鉴定为warifteine，亚组分6经超高效液相色谱-高分辨飞行时间串联质谱（UPLC-QTOF-MSE）分析证明为methylwarifteine与warifteine的混合物（比例87.5%:12.5%）。第三步是细胞毒性评价，采用Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）和MTT法测定各样品对细胞活力的影响，计算50%细胞毒性浓度（CC50）和20%细胞毒性浓度（CC20）。结果显示粗乙醇提取物毒性最高（CC50为13.35 μg/ml），TAFRZ及其亚组分毒性较低，warifteine的CC50为89.00 μg/ml，阳性对照6-甲基巯基嘌呤核苷（6-MMPR）的CC50为86.00 μg/ml。第四步是抗病毒活性筛选，采用Vero细胞感染模型和致细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）评价方法。Vero细胞以感染复数（multiplicity of infection, MOI）0.1接种寨卡病毒PE243株2小时后，加入各样品（浓度为各自CC20）持续培养120小时，然后收集上清液通过半数组织培养感染剂量（TCID50）法测定病毒滴度（viral titer）的下降程度。实验结果显示TAFRZ的6个亚组分中有3个（亚组分4、5、6）能够显著降低病毒滴度，其中亚组分5（warifteine）活性最强，在10.49 μg/ml浓度下可抑制80%的病毒滴度；亚组分6可抑制40–60%；亚组分4活性较弱但也具有统计学意义。第五步是剂量-效应关系与选择性指数（selectivity index, SI）的测定，通过非线性回归计算50%抑制浓度（IC50）。结果显示warifteine的IC50为2.2 μg/ml，选择性指数为68.3；亚组分6的IC50为3.5 μg/ml，选择性指数为6.14；阳性对照6-MMPR的IC50为24.5 μg/ml，选择性指数为11.9。按摩尔浓度计算，warifteine的抗病毒效力约为6-MMPR的22倍。第六步是细胞病变效应保护的形态学观察，通过倒置显微镜记录warifteine对Vero细胞单层的保护作用。结果显示warifteine能有效阻止寨卡病毒感染引起的细胞皱缩、脱落和合胞体形成等致细胞病变效应，维持细胞单层的完整性。

在结果与讨论中，研究团队首先阐述了生物碱的鉴定依据。亚组分5在分析型HPLC上呈单一峰，其¹H NMR谱和高分辨质谱数据与文献报道的warifteine一致。亚组分6的¹H NMR数据显示其为methylwarifteine，但UPLC-QTOF-MSE进一步揭示其为methylwarifteine与warifteine的混合物，二者峰面积比为8.8:1.2。由于亚组分6产量较低，未进行进一步纯化即用于抗病毒实验。其次，研究团队比较了各样品对Vero细胞的毒性。粗乙醇提取物毒性最高，这可能是因为乙醇提取物含有极性和非极性多种物质，而酸碱萃取制备TAFRZ的过程排除了这些高毒性成分。warifteine的CC50与6-MMPR相近，说明其细胞毒性处于可接受范围。再次，抗病毒筛选结果表明warifteine是最有效的活性成分，其活性显著优于阳性对照6-MMPR。亚组分6的活性虽然也显著，但其选择性指数较低（6.14），主要原因是细胞毒性较高（CC50为21.49 μg/ml）。研究团队推测纯methylwarifteine在摩尔基础上可能比warifteine更有效，但需要未来进一步验证。此外，研究团队讨论了warifteine保护Vero细胞免受寨卡病毒致细胞病变效应的可能机制。此前有报道warifteine具有抗炎作用，可通过干扰中性粒细胞黏附和迁移发挥作用。但Leite等人2016年的研究发现warifteine和methylwarifteine不能降低登革病毒感染细胞中TNF-α、IL-8或巨噬细胞迁移抑制因子的产生。这表明除了已知的免疫调节作用外，这些生物碱可能直接作用于病原体本身，例如抑制病毒进入宿主细胞或干扰病毒复制复合体的功能。研究团队还指出，Leite等人2016年报道warifteine对登革病毒无抗病毒活性的结果，可能是因为其样品制备采用盐酸溶解形成生物碱盐酸盐，导致细胞膜通透性降低。本研究改用二甲基亚砜（DMSO）溶解样品，这可能是结果差异的原因。

研究结论认为，warifteine和methylwarifteine具有显著的体外抗寨卡病毒活性，且warifteine的效力和选择性均优于阳性对照6-MMPR。这些双苄基异喹啉类生物碱可作为新的抗病毒先导化合物或药效团（pharmacophore）用于寨卡病毒抗病毒药物的开发。研究团队同时强调，由于未进行分子机制的表征，这些结果应被视为初步发现，后续需要进一步确认和阐明其抗病毒作用机制。

本研究的亮点在于：其一，首次系统地报道了C. sympodialis中双苄基异喹啉类生物碱对寨卡病毒的体外抗病毒活性；其二，采用生物测定导向的分级分离策略，从复杂的植物提取物中成功追踪并鉴定出活性成分warifteine；其三，发现warifteine的体外抗寨卡病毒效力显著优于已知具有抗寨卡病毒活性的核苷类似物6-MMPR，且选择性指数更高；其四，通过样品溶解方式的优化（使用DMSO而非盐酸）解决了此前文献中结果不一致的问题，强调了样品制备方法对生物碱类化合物活性评价的重要影响。此外，研究还建立了从C. sympodialis根茎中提取、分离和鉴定warifteine及methylwarifteine的完整实验流程，为后续大规模制备和深入研究提供了方法学基础。