单克隆抗体大规模冻融过程中聚集行为评价研究学术报告

一、 研究作者、单位及发表信息 本研究由 Oliver Bluemel (Ludwig-Maximilians-Universitaet Muenchen, Germany), Miguel A. Rodrigues (Instituto Superior Técnico, Portugal), Jakob W. Buecheler, Karoline Bechtold-Peters, Wolfgang Friess 等多位学者合作完成。研究论文《Evaluation of Two Novel Scale-Down Devices for Testing Monoclonal Antibody Aggregation During Large-Scale Freezing》发表于学术期刊 Journal of Pharmaceutical Sciences 第111卷（2022年），第1973–1983页。

二、 学术背景与研究目的 本研究隶属于生物制药领域，具体聚焦于治疗性蛋白质药物（尤其是单克隆抗体，Monoclonal Antibody, mAb）生产工艺中的稳定性问题。在工业规模生产中，为延长原料药（drug substance）的保质期、提供生产灵活性并降低运输风险，常将高浓度的单克隆抗体溶液进行冷冻储存。然而，冷冻与融解（Freezing and Thawing， FT）过程会引入一系列压力，可能导致蛋白质发生聚集（aggregation），形成高分子量物种（Higher Molecular Weight Species， HMWs）和亚可见颗粒（Subvisible Particles， SVPs），从而影响药物的疗效、安全性和质量。

在配方和工艺开发阶段，通常需要进行小规模的冻融研究来评估不同条件对蛋白质稳定性的影响。然而，小规模（如小瓶）冻融过程的热力学历史和物理环境（如冰晶大小、冷冻浓缩程度、压力暴露时间）与大规模容器（如2升瓶）存在显著差异，导致小规模实验结果往往无法准确预测大规模生产中的蛋白质稳定性风险。

因此，本研究旨在评估两种新型的规模缩小设备（Scale-Down Devices， SDD）能否有效模拟单克隆抗体在2升大规模瓶中进行冻融时所经历的应力，从而精确预测其聚集行为。这两种设备旨在用极少的样品量（分别为100毫升和5.5毫升）重现大规模冻融的关键参数，以支持高效的配方筛选和工艺开发。

三、 详细研究流程与方法

本研究设计了一套系统的实验流程，比较了在传统2升瓶、无屏蔽的125毫升瓶、新型规模缩小设备（SDD）、传统10毫升小瓶以及微型规模缩小设备（Micro Scale-Down Device， MSDD）中，三种不同单抗溶液经过多次冻融循环后的聚集情况。具体工作流程如下：

1. 研究材料准备：研究使用了两种IgG1单克隆抗体：Mab1和Mab2。Mab1储存液浓度为185 mg/mL，稀释至终浓度5 mg/mL（使用20 mM组氨酸缓冲液，pH 5.5）。Mab2储存液浓度为85 mg/mL，直接使用或稀释至终浓度1 mg/mL（使用25 mM己二酸缓冲液，pH 5.2）。所有样品均经过0.2 μm过滤。

2. 冻融设备与条件：

   • 2升瓶、SDD、125毫升瓶：将2升PET瓶（装液1.6 L）、装有100 mL样品的SDD以及无屏蔽的125 mL PET瓶（装液100 mL）同时置于空气冷冻箱（-40°C）中处理。冻融循环包括：20°C平衡1小时，以最大速率冷却至-40°C并保持10小时（确保完全冷冻），再以最大速率加热至20°C并保持16小时（确保完全融化）。每次循环后温和混匀并取样。
   • 10毫升小瓶：作为对照，将装有5.5 mL样品的10 mL小瓶置于同一冷冻箱中，采用简化的循环（冷却至-40°C保持1.5小时，再加热至20°C保持2小时）。
   • 微型规模缩小设备（MSDD）：这是一种新型设备，通过控制底部不锈钢板（填充乙醇）的温度程序来精确调控10 mL小瓶（装液5.5 mL）的热历史。其设计基于计算流体动力学（Computational Fluid Dynamics， CFD）模拟，旨在匹配2升瓶在特定平均传热系数（本研究设为27 W/(m²K)）下的累积热应力时间。样品在MSDD中进行冻融循环，程序包括多个斜坡和平台期以延长样品在冷冻温度与玻璃化转变温度（Tg’）之间的停留时间。

3. 分析方法：对冻融前后的样品进行多项物化分析，全面评估聚集程度：

   • 体积排阻色谱（Size-Exclusion Chromatography， SEC）：用于定量分析可溶性高分子量聚集物（HMWs）的百分比。
   • 流动成像显微镜（Flow Imaging Microscopy）：用于计数尺寸≥1 μm的亚可见颗粒（SVPs）。
   • 动态光散射（Dynamic Light Scattering， DLS）：用于测量平均流体力学半径（Rh）和多分散指数（Polydispersity Index， PDI），以评估颗粒大小分布和样本均一性。
   • 光学密度（Optical Density at 350 nm）：用于评估溶液的浊度变化。

4. 新型设备介绍：

   • SDD：该设备由一个3D打印的外壳构成，包裹着一个125毫升的瓶子。外壳内填充1%乙醇，通过绝缘其中两面墙壁来操控热交换，从而模拟2升瓶的热传递和冷冻浓缩过程。其设计目标是实现16倍的样品体积缩减（从1.6 L到100 mL）。
   • MSDD：该设备进一步将所需样品体积缩减近300倍（至5.5 mL）。它不通过绝缘来改变热交换，而是通过一个可编程的温度控制系统，从底部精确控制小瓶的冷却和加热曲线，以模拟大规模容器中更长的应力暴露时间。

四、 主要研究结果详述

本研究对三种单抗配方进行了五次冻融循环测试，结果揭示了不同规模缩小策略的有效性。

1. 对稳定的单抗溶液（5 mg/mL Mab1）：在2升瓶中进行五次冻融后，HMWs水平未增加，SVPs虽有轻微上升但总体变化不大，DLS参数（Rh和PDI）仅小幅增加。无屏蔽的125毫升瓶和SDD均能准确地复现这一结果，表明对于稳定的配方，即使简单的体积缩减也能提供可靠的预测。

2. 对高浓度单抗溶液（85 mg/mL Mab2）：该溶液在2升瓶中表现出一定的冻融敏感性，HMWs轻微增加，SVPs数量显著上升。无屏蔽的125毫升瓶和SDD均能匹配HMWs的形成趋势。然而，SDD产生的SVPs数量（112，200 particles/mL）略高于2升瓶（54，000 particles/mL）和125毫升瓶（63，600 particles/mL）。这可能是由于SDD通过延长应力时间，略微放大了聚集效应。DLS和光学密度在此高浓度下未检测到显著变化，可能被高蛋白浓度所掩盖。

3. 对高度敏感的低浓度单抗溶液（1 mg/mL Mab2）：该溶液对冻融应力最为敏感，是评价规模缩小设备性能的关键模型。

   • 在2升瓶中：HMWs从0.24%显著增加至1.25%，SVPs大幅增加至108，100 particles/mL，DLS参数（Rh从4.9 nm增至5.7 nm，PDI从0.01增至0.38）也显著上升，表明形成了大量可溶性和不溶性聚集体。
   • 无屏蔽的125毫升瓶：能够较好地匹配不溶性聚集（SVPs）的形成趋势，但显著低估了可溶性聚集（HMWs）的形成（仅增至0.96%）。
   • SDD：在预测SVPs形成方面与2升瓶结果吻合良好，但导致更高的HMWs水平（增至1.55%），略高于2升瓶。这表明SDD可能代表了大规模冻融的“最坏情况”（worst-case）场景，在配方开发中具有保守预测的价值。
   • 10毫升小瓶（传统方法）：在相同冷冻箱中处理的10 mL小瓶严重低估了所有聚集指标（HMWs无变化，SVPs仅轻微增加），证实了传统小规模冻融实验缺乏代表性。
   • MSDD：与传统的10 mL小瓶相比，MSDD通过控制温度曲线显著增加了冻融应力，导致HMWs（增至0.63%）和SVPs（31，700 particles/mL）明显增加。然而，其诱导的聚集程度仍略低于2升瓶的结果，特别是DLS参数的变化较小（Rh 5.2 nm， PDI 0.14）。这表明MSDD在代表性方面优于普通小瓶，但仍有优化空间以完全匹配大规模条件。

五、 研究结论与意义

本研究得出结论，两种新型规模缩小设备（SDD和MSDD）能够以大幅减少样品体积的方式（分别减少16倍和近300倍），比简单地使用更小的容器（如125 mL瓶或10 mL小瓶）更准确地表征单克隆抗体对大规模冻融的敏感性。

具体而言： * SDD（基于125毫升瓶）：对于稳定的和高浓度的单抗溶液，其预测效果与无屏蔽的125毫升瓶相当。然而，对于高度敏感的稀溶液，无屏蔽的125毫升瓶会低估可溶性聚集体的形成，而SDD则可能略微高估，使其可被用作工艺开发中的“最坏情况”评估工具。此外，SDD能更真实地模拟大规模冷冻时的冷冻浓缩现象，因此也可用于评估长期冷冻储存的稳定性。 * MSDD（基于10毫升小瓶）：通过程序化控制热历史，MSDD显著增强了传统小瓶冻融实验的应力，使其结果更接近大规模情况。它为解决极小样品量下的代表性冻融测试提供了一个新颖且有效的途径，尽管在本研究中其诱导的聚集水平仍略低于2升瓶。

该研究的科学价值在于系统地验证了基于CFD模拟原理设计的物理规模缩小设备的有效性，为生物制药行业提供了可靠的工具，能够在早期研发阶段用极少的珍贵样品量，更准确地评估大规模冻融工艺对蛋白质稳定性的潜在风险。其应用价值巨大，有助于优化配方、开发稳健的冻融工艺、降低开发成本并加速产品上市。

六、 研究亮点

1. 系统性比较：研究首次对两种基于不同原理（热交换控制 vs. 温度程序控制）的新型规模缩小设备进行了并行评估，并与传统的不同体积容器进行了直接对比，数据全面。
2. 多维度分析：研究采用了SEC、流动成像显微镜、DLS和光学密度等多种互补的分析技术，从可溶性聚集体、不溶性颗粒、粒径分布和浊度等多个角度全面评估了蛋白质聚集状态。
3. 明确的结论与指导价值：研究明确指出，对于冻融稳定的单抗，简单的体积缩减（125 mL瓶）可能足够；但对于敏感的单抗，新型SDD（特别是MSDD）能提供更可靠的预测，并指出了各自的应用场景（如SDD用于最坏情况评估，MSDD用于微量样品筛选）。
4. 聚焦实际问题：研究直接回应了工业界在单抗药物开发中面临的“规模放大/缩小”挑战，具有很高的实际应用针对性。

七、 其他有价值的内容

研究在讨论部分对结果进行了深入分析，例如： * 解释了125毫升瓶中SVPs计数可能更高的原因，归因于更快的冷冻速率可能产生更多更小的冰晶，从而增大了冰-水界面面积，可能加剧了界面诱导的蛋白质变性。 * 分析了MSDD未能完全匹配2升瓶结果的可能原因，包括：大规模实验实际冷冻温度（-40°C）与CFD模拟设定（-80°C）的差异导致实际应力时间更长；大规模冷冻箱内可能存在不均匀的热传递；MSDD程序中冰完全融化时间的实际观察值与理论值的偏差；以及不同配方溶质导致的冰点下降可能对过程产生影响。这些分析为设备的进一步优化提供了方向。