研究发现异甘草素可显著减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤，其作用机制与激活Nrf2/HO-1/SLC7A11/GPX4信号轴并抑制铁死亡密切相关

近日，来自中国的研究团队在《Free Radical Biology and Medicine》期刊上发表了一项题为“Isoliquiritigenin alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury by regulating the Nrf2/HO-1/SLC7A11/GPX4 axis in mice”的研究。这项研究由扬州大学附属医院心血管内科的Kaizheng Gong 教授及其团队完成，Deshan Yao、Liuxiang Bao和Sichuan Wang为共同第一作者，论文于2024年5月在线发表。该研究聚焦于心血管疾病研究领域，旨在探索源自甘草的天然黄酮类化合物——异甘草素（Isoliquiritigenin， ISL）对心肌缺血再灌注（I/R）损伤的保护作用及其分子机制。随着急性心肌梗死发病率和再灌注治疗的普及，再灌注过程本身带来的损伤（即I/R损伤）成为影响患者预后的关键问题，其中涉及多种细胞死亡形式。近年研究表明，随着再灌注时间的延长，铁依赖性的脂质过氧化驱动的细胞死亡形式——铁死亡（Ferroptosis），在心肌长期功能障碍中扮演了至关重要的角色。尽管异甘草素因其广泛的药理活性（如抗炎、抗氧化、抗癌）而备受关注，但其在心肌I/R损伤引发的铁死亡中的作用尚不明确。因此，本研究旨在验证一个核心假设：异甘草素是否能够通过调控核心的抗氧化转录因子核因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）及其下游通路，进而减轻心肌细胞的铁死亡，最终达到保护心肌、缩小梗死面积的目的。

为了系统验证这一假设，研究团队设计并实施了一系列严谨的体外和体内实验。整个研究流程可分为三大核心部分：体外细胞实验验证机制、体外机制深入探究与拯救实验、以及体内动物模型验证。在第一部分体外实验中，研究人员首先从1-3日龄的C57BL/6J小鼠心室组织中分离培养了新生小鼠心肌细胞（Neonatal mouse cardiomyocytes， NMCMs），作为研究心肌损伤的细胞模型。通过缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation， H/R）处理来模拟体内的I/R病理过程。在构建H/R模型前，研究设置了不同浓度的异甘草素处理组（5、25、50 μmol/L），以评估其剂量效应。实验中，他们检测了一系列关键指标：使用DCFH-DA荧光探针和DHE染色评估活性氧（ROS）水平；利用商业试剂盒测定细胞培养液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性（细胞损伤标志物）以及细胞内的丙二醛（MDA，脂质过氧化产物）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性（抗氧化酶）；通过CCK-8实验检测细胞在不同复氧时间点的活力，并联合使用了多种细胞死亡抑制剂（如铁死亡抑制剂Ferrostatin-1、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK等）以明确死亡主导类型；利用Western Blot技术分析铁死亡相关蛋白，包括促铁死亡的酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）、抑铁死亡的谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和胱氨酸/谷氨酸逆向转运体SLC7A11的表达；通过ELISA检测4-羟基壬烯醛（4-HNE，另一重要脂质过氧化产物）水平；并使用FerroOrange荧光探针可视化检测细胞内游离Fe2+的积累情况。

第二部分是深入的机制验证与“拯救”实验。研究团队聚焦于Nrf2/HO-1通路。通过提取细胞核蛋白进行Western Blot，检测了H/R及异甘草素处理后Nrf2向细胞核的转位情况及其下游靶基因血红素氧合酶-1（HO-1）的表达变化。关键的一步是引入了Nrf2的特异性抑制剂ML385。在给予异甘草素预处理的同时加入ML385，观察其对异甘草素上述保护效应的阻断作用，从而逆向验证Nrf2通路的核心地位。此外，为了进一步确认铁死亡是异甘草素保护作用的靶点，研究还使用了铁死亡诱导剂RSL3（GPX4抑制剂）进行“再挑战”实验，即在给予异甘草素保护后，再用RSL3诱导铁死亡，观察GPX4、SLC7A11、ACSL4表达及相关氧化损伤指标的变化，以检验异甘草素的保护效果是否会被削弱。

第三部分是将机制研究推向体内的动物模型验证。研究使用了50只健康的雄性C57BL/6J小鼠，通过手术结扎左冠状动脉前降支30分钟后松开实现再灌注，成功构建了心肌I/R模型。小鼠被随机分为5组：假手术组（Sham）、溶媒对照组+I/R组、异甘草素+I/R组、ML385+I/R组、以及异甘草素+ML385+I/R组。异甘草素（100 mg/kg/day）和ML385（30 mg/kg/day）在术前3天开始通过腹腔注射进行预处理。I/R模型构建7天后，处死小鼠获取心脏组织进行分析。评估手段多样且全面：采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色量化心肌梗死面积；通过冰冻切片进行ROS荧光染色；利用H&E染色观察心肌组织病理形态；使用Lillie’s亚铁染色法检测心肌组织中Fe2+的沉积；通过免疫组织化学染色观察Nrf2的核定位情况。此外，还提取心肌组织蛋白，利用Western Blot检测组织中Nrf2、HO-1、GPX4、SLC7A11、ACSL4以及线粒体分裂相关蛋白Drp1的表达。同样，也测定了组织中的MDA含量和SOD活性。更为直观的是，研究还通过透射电子显微镜观察了各组心肌细胞线粒体的超微结构变化。所有的数据均使用GraphPad Prism软件进行统计分析，采用双因素方差分析等方法，以P<0.05为差异具有统计学意义。

本研究取得了系统而确凿的成果，逐层揭示了异甘草素的作用机制。在体外细胞实验中，异甘草素呈剂量依赖性地显著减轻了H/R诱导的氧化应激损伤：降低了ROS荧光强度、MDA含量和LDH活性，同时提升了抗氧化酶SOD和CAT的活性。CCK-8实验结果显示，在24小时长时间复氧后，铁死亡抑制剂Ferrostatin-1能显著改善细胞活力，而异甘草素处理产生了与Ferrostatin-1相似的效果，提示在长期复氧损伤中，铁死亡是主要死亡形式，且异甘草素能对抗这一过程。Western Blot和ELISA结果进一步证实，异甘草素处理下调了促铁死亡蛋白ACSL4和4-HNE的表达，上调了抑铁死亡关键蛋白GPX4和SLC7A11的表达。FerroOrange探针检测显示，异甘草素有效减少了H/R导致的细胞内Fe2+异常积累。这些数据共同表明，异甘草素能够抑制H/R诱导的心肌细胞脂质过氧化和铁死亡。

机制探究部分的结果清晰地指向了Nrf2/HO-1通路。研究发现，H/R本身会激活心肌细胞的Nrf2通路（促使Nrf2核转位并上调HO-1表达），这是一种内源性的代偿反应。而异甘草素预处理则进一步强化了这一过程。然而，当使用ML385抑制Nrf2功能后，异甘草素所带来的上述所有益处——包括抗氧化酶活性提升、氧化损伤产物减少、GPX4/SLC7A11表达上调、ACSL4/4-HNE表达下调以及细胞内Fe2+积累的减少——几乎被完全抵消。这直接证明了异甘草素是通过激活Nrf2来发挥其抗氧化和抗铁死亡作用的。此外，在RSL3“再挑战”实验中，RSL3部分逆转了异甘草素对GPX4/SLC7A11的上调和对ACSL4的下调作用，并削弱了其抗氧化效应，这从另一角度证实了异甘草素的保护作用与维持GPX4等铁死亡抑制蛋白的功能密切相关。

体内动物实验的结果有力地支持了体外发现的结论，并展示了最终的生理病理学终点改善。在I/R小鼠模型中，异甘草素治疗显著促进了心肌组织中Nrf2的核转位，增强了HO-1、GPX4和SLC7A11的蛋白水平，同时抑制了ACSL4的表达。与体外结果一致，ML385同样阻断了异甘草素在体内的这些效应。功能上，异甘草素处理显著减小了TTC染色所显示的心肌梗死面积，减轻了H&E染色下的心肌组织结构损伤，降低了组织ROS水平和MDA含量，提升了SOD活性。Lillie’s亚铁染色显示异甘草素减少了心肌中的铁沉积。尤为重要的是，透射电镜观察发现，I/R损伤导致心肌线粒体肿胀、嵴结构紊乱甚至外膜破裂，而异甘草素处理明显改善了这些线粒体形态异常，同时伴随线粒体分裂蛋白Drp1表达的降低。所有这些保护作用，均在联合使用ML385后被基本取消，从而在动物整体水平上确立了“异甘草素—Nrf2激活—抗氧化/抗铁死亡—心肌保护”的因果链条。

本研究得出明确结论：异甘草素能够有效减轻心肌缺血再灌注损伤。其核心机制在于通过激活Nrf2转录因子，促进其下游靶基因HO-1、SLC7A11和GPX4的表达，从而构建起一个强大的抗氧化防御网络。这个网络一方面直接减轻氧化应激损伤，另一方面通过上调GPX4（还原脂质过氧化物）和SLC7A11（维持谷胱甘肽合成），同时抑制ACSL4（减少易过氧化脂质的合成），协同抑制了脂质过氧化产物的积累和细胞内游离铁的毒性，最终阻断了心肌细胞铁死亡的发生。此外，这种保护作用还延伸至改善线粒体结构和功能。因此，异甘草素代表了一种通过多靶点干预I/R损伤关键病理环节（氧化应激、铁死亡、线粒体损伤）的潜在治疗策略。

本研究的亮点突出。在科学发现层面，它首次系统阐明了异甘草素在心肌I/R损伤中对铁死亡的抑制作用及其精确的分子通路（Nrf2/HO-1/SLC7A11/GPX4轴），将一种天然产物的药理作用与当前细胞死亡研究的前沿领域“铁死亡”紧密连接，深化了对I/R损伤晚期病理机制的理解。在研究方法和设计层面，工作非常系统和严谨，采用了从体外细胞到体内动物的完整模型体系，并巧妙地运用了Nrf2特异性抑制剂ML385和铁死亡诱导剂RSL3进行正反两方面的“功能获得”与“功能丧失”验证，使得因果论证非常有力。多种技术手段（分子生物学、生化检测、组织病理、超微结构观察）的综合运用，从不同维度提供了相互印证的数据。在应用价值层面，该研究为将异甘草素或其衍生物开发成为治疗心肌I/R损伤的候选药物提供了重要的临床前实验依据。鉴于铁死亡在多种器官（脑、肾、肝）的I/R损伤及退行性疾病中均扮演重要角色，该研究揭示的机制也可能为异甘草素在其他疾病领域的应用提供新思路。最后，论文在讨论部分也客观指出了研究的局限性，例如I/R损伤是一个涉及自噬、炎症、纤维化、代谢紊乱等多因素的复杂过程，未来研究需要更全面地评估异甘草素对这些方面的潜在影响，以更完整地认识其治疗价值。