体外抗菌活性评价方法综述

作者与发表信息

本文发表于 Journal of Pharmaceutical Analysis 第6卷第2期（2016年），页码为71至79。第一作者为Mounyr Balouiri，通讯作者亦为Mounyr Balouiri（b.mounyr@gmail.com），其研究团队Moulay Sadiki与Saad Koraichi Ibnsouda均来自摩洛哥菲斯市西迪·穆罕默德·本·阿卜杜拉大学科学技术学院微生物生物技术实验室。该文于2015年8月22日收稿，2015年11月21日收到修改稿，2015年11月23日接受，2015年12月2日在线发表。

论文性质判断

本文属于类型b，即一篇综述性科学论文（review paper），而非单一原始研究报告。其目的是系统梳理和阐述当前用于体外评价抗菌活性的各类方法，为研究人员在药物发现、流行病学调查及疗效预测等场景中选择合适方法提供参考依据。

主论点一：抗菌药敏试验的必要性及方法分类框架

文章开篇指出，在抗生素“黄金时代”之后，微生物耐药性的急剧上升已成为全球公共卫生的重大威胁，多药耐药细菌导致的治疗失败日益普遍。因此，发现新型抗菌药物成为当务之急，而天然产物（植物、微生物、动物来源）仍是新药分子的主要来源之一。然而，由于文献中不同研究采用了不同的接种物制备方法、接种量、培养基和培养条件，导致不同实验室的结果难以比较。为此，作者提出了系统评估体外抗菌活性评价方法的必要性。文章将所有方法归纳为四大类：扩散法（diffusion methods）、薄层色谱—生物自显影法（thin-layer chromatography–bioautography）、稀释法（dilution methods）以及时间—杀菌曲线法（time-kill test）和流式细胞术等深度研究方法。

主论点二：扩散法是最基础且应用最广泛的初筛手段

扩散法部分详细阐述了四种具体技术。首先是琼脂纸片扩散法（agar disk-diffusion method），该方法由Heatley于1940年发展而来，目前被临床与实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）标准化，适用于细菌和酵母菌的常规药敏试验。其操作流程为：将标准化接种物涂布于琼脂平板表面，放置含待测药物的滤纸片（直径约6 mm），孵育后测量抑菌圈直径。该方法优点在于简单、成本低、可同时测试大量菌株和药物，且结果与体内疗效相关性良好，但其局限在于无法区分杀菌与抑菌作用，也不能精确测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）。其次是抗菌梯度法（antimicrobial gradient method, Etest），该方法结合稀释法与扩散法的原理，使用含连续浓度梯度抗生素的塑料条，通过抑菌椭圆与条带的交点直接读取MIC值，操作简便且与肉汤稀释法结果相关性好，但单条成本约2–3美元，大规模测试时费用较高。第三类为其他扩散方法，包括琼脂孔扩散法（agar well diffusion method）、琼脂塞扩散法（agar plug diffusion method）、交叉划线法（cross streak method）和毒饵法（poisoned food method）。琼脂孔扩散法在琼脂表面打孔后注入待测物，主要用于植物或微生物提取物的筛选；琼脂塞扩散法用于检测微生物之间的拮抗作用；交叉划线法通过将待测菌与目标菌以垂直方向划线接种来快速筛选拮抗关系；毒饵法则主要针对霉菌的抗真菌评价，通过将待测物掺入融化琼脂后测量菌落直径并计算抗真菌活性百分比。

主论点三：薄层色谱—生物自显影法是分离与活性检测联用的高效手段

TLC—生物自显影法将薄层色谱的分离能力与生物活性检测相结合，最早由Goodall和Levi在1946年将纸色谱与接触生物自显影联用以检测青霉素，此后Fischer和Lautner将薄层色谱引入该领域。该法包括三种技术路线。第一是琼脂扩散（agar diffusion）或称琼脂接触法，将色谱板上的抗菌物质通过扩散转移至预先接种的琼脂平板上，孵育后出现抑菌圈。第二是直接生物自显影法（direct bioautography），将展开后的TLC板浸入或喷洒微生物悬浮液，在25 °C潮湿条件下孵育48小时，然后用四唑鎓盐（tetrazolium salts）喷洒，通过活细胞脱氢酶将其转化为有色甲臢（formazan）来显示活性斑点；该方法操作最为简便，适用于真菌和细菌，尤以产孢真菌如曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）和枝孢属（Cladosporium）效果最佳。第三是琼脂覆盖生物测定法（agar overlay bioassay），又称浸泡生物自显影法，将熔融的含菌琼脂覆盖在TLC板表面，低温放置数小时以利于扩散，孵育后染色观察；该法提供的抑菌圈边界清晰，不易受污染，适用于白色念珠菌（Candida albicans）和霉菌等各类微生物。总体而言，TLC—生物自显影法简单、有效、成本低廉，特别适合复杂混合物的活性导向分离，能够快速定位活性成分，在环境监测和食品样品中抗菌物质的检测方面也有应用前景。

主论点四：稀释法是精确测定MIC的标准化方法

稀释法被公认为测定MIC最适宜的手段，分为肉汤稀释法（broth dilution method）和琼脂稀释法（agar dilution method）。肉汤稀释法又包括常量稀释和微量稀释两种方式。微量稀释法使用96孔微量滴定板，将抗菌药物进行二倍系列稀释（如1、2、4、8、16和32 μg/mL），每孔接种终浓度约为5×10⁵ CFU/mL的微生物，孵育后以肉眼观察完全抑制生长的最低浓度作为MIC。该方法的主要优势在于试剂和空间的经济性以及重复性好，但其结果受接种量、培养基类型、孵育时间和接种物制备方法显著影响。为提高终点判定的客观性，多种比色法被开发出来，包括四唑鎓盐类如MTT和XTT以及刃天青（resazurin）染料等。在测定MIC之后，还可以通过传代培养来确定最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）或最低杀真菌浓度（minimum fungicidal concentration, MFC），其终点定义为能杀灭99.9%（MBC）或98%–99.9%（MFC）最终接种物的最低药物浓度。琼脂稀释法则将系列浓度的抗菌药物掺入融化琼脂中，将标准化菌悬液点种于琼脂表面，以完全抑制生长的最低浓度作为MIC。该法特别适用于测试多种菌株对单一药物的敏感性，以及当待测药物颜色过深干扰液体培养基中生长判断的情况。对于厌氧菌和螺杆菌属（Helicobacter）等苛养菌，琼脂稀释法常被推荐为标准化方法。

主论点五：时间—杀菌曲线、ATP生物发光法和流式细胞术可提供杀菌动力学及细胞损伤信息

时间—杀菌试验（time-kill test）是确定杀菌或杀真菌效果的最重要方法，能揭示药物与微生物之间的动态相互作用，并区分时间依赖型和浓度依赖型抗菌效应。CLSI的M26-A文件对该方法进行了标准化。操作流程为在肉汤培养基中设置三支试管，分别含0.25×MIC、1×MIC药物浓度及无药对照，接种量为5×10⁵ CFU/mL，在不同时间点（0、4、6、8、10、12和24小时）取样计数活菌数，以相对对照的死亡百分比评价杀菌效力。通常6小时达到90%致死率或24小时达到99.9%致死率即视为具有杀菌效果。该方法还可用于评价两种或多种药物的协同或拮抗作用。

ATP生物发光法基于萤光素酶催化D-萤光素与ATP反应产生光信号的原理，通过光度计测量相对光单位来定量活细胞数。ATP在活细胞中含量相对恒定，因此发光强度与细胞活力呈线性关系。该方法的主要优势在于快速，尤其在抗分枝杆菌测试中可在3–5天获得结果，而传统稀释法需3–4周。此外，该法还可用于生物膜的原位评估和体内抗菌测试。

流式细胞术（flow cytofluorometric method）通过荧光染料染色快速检测细胞损伤。碘化丙啶（propidium iodide, PI）作为DNA嵌入染料广泛用于膜损伤评价，羧基荧光素二乙酸酯（carboxyfluorescein diacetate, CFDA）用于检测酯酶活性。通过双染色可清楚区分死细胞、活细胞和受损细胞三个亚群。受损细胞在食品微生物学中具有重要意义，因为在温度波动等条件下这类细胞可能恢复生长。该法的结果重现性好且可在2–6小时内快速获得，明显快于微量稀释法的24–72小时，但由于流式细胞仪设备在普通实验室的可及性有限，其广泛应用目前仍受到限制。

论文的意义与价值

该综述系统全面地总结了体外抗菌活性评价的各类方法，从经典的扩散法到标准化程度较高的稀释法，再到能提供杀菌动力学和细胞损伤信息的深度研究方法，形成了一个方法学谱系。文章特别强调了CLSI和欧洲抗菌敏感性试验委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST）等机构在方法标准化方面的贡献，为实验室间结果的可比性奠定了基础。同时，作者也指出当测试天然产物时，往往需要对标准化方案进行适当修改，但必须在保持微生物学基本原则不被破坏的前提下进行。对于从事抗菌药物发现、天然产物活性筛选以及临床微生物学工作的研究人员而言，本文提供了一份务实的操作指南和方法选择参考，具有重要的实用价值。