本文所报告的研究由吴祥毅（Xiangyi Wu）、黄丹青（Danqing Huang）、徐烨（Ye Xu）、陈国璞（Guopu Chen）及赵远锦（Yuanjin Zhao）等学者共同完成。通讯作者为赵远锦教授，其隶属机构包括南京大学医学院附属鼓楼医院烧伤整形科与转化医学研究所、东南大学生物科学与医学工程学院生物电子学国家重点实验室，以及中国科学院大学温州研究院瓯江实验室（再生医学、视觉与脑健康浙江省实验室）。该项研究成果于2023年5月26日在线发表于国际知名学术期刊 Advanced Materials，论文DOI为10.1002/adma.202301064。
本研究属于生物医学工程与再生医学交叉领域，聚焦于糖尿病慢性伤口（diabetic wound）的治疗难题。糖尿病伤口是一种常见的延迟愈合伤口，其病因及发病机制复杂，通常表现出预后差、致残率高和致死率高的特点。传统的治疗策略，如外科清创（surgical debridement）、伤口减压和抗感染治疗，往往效果不理想，复发率高。
近年来，基于干细胞的治疗策略为糖尿病伤口修复带来了革命性的前景。已有研究证实，干细胞通过分泌多种内源性和外源性细胞因子来促进细胞存活并调节炎症，同时能够分化为皮肤细胞并释放细胞外囊泡（extracellular vesicles）。进一步地，将干细胞与水凝胶（hydrogel）等生物相容性材料结合形成支架（hydrogel-SC scaffolds），可以为封装的干细胞提供力学支撑并稳定其功能。然而，这种块状支架缺乏精确的结构设计，难以实现干细胞的精准递送和物质交换，且分散分布的细胞缺乏充分的细胞间相互作用，导致其在复杂病理环境中的适应能力和功能表达不佳。
针对上述挑战，本研究提出了一种全新的治疗平台：利用微流控模板技术（microfluidic templating technology）制备负载干细胞球体（stem cell spheroids, sps）的微针（microneedle, mn）贴片，即MN@sps贴片。研究目标在于通过微流控芯片原位生成尺寸均一的干细胞球体，并将其高效负载于透明质酸甲基丙烯酰（hyaluronic acid methacryloyl, HAMA）水凝胶微针中，以实现活性物质的精准递送与交换，最终促进糖尿病伤口的血管新生（neovascularization）、胶原沉积（collagen deposition）和组织重建。
本研究的工作流程可系统地划分为四个主要阶段：微流控芯片构建与干细胞球体制备、干细胞球体表征与转录组学分析、MN@sps贴片制备与体外功能验证，以及糖尿病小鼠模型体内疗效评价。
第一阶段：模板集成微流控芯片的构建与干细胞球体的原位生成。 研究团队自行设计并制备了一种双层聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片。该芯片中央具有一个10×10的四边形锥形微孔阵列，每个微孔深600微米，底边边长200微米，芯片两端设有液体流入和流出的通道。为了促进细胞聚集成球并减少贴壁，芯片表面预先用疏水性试剂F127处理。实验使用的细胞为脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）。通过精确控制微流体，高浓度的细胞悬液被均匀灌注并分配到各个微孔中。细胞在重力作用下沉降并聚集于微孔底部，在持续流动的培养液微环境中，经过约72小时培养，原位形成了形态均匀、直径约为150微米的细胞球体。此阶段的技术关键在于利用微流控模板对流体和细胞的精确操控能力，克服了传统细胞球体制备方法中尺寸不均一和难以大规模生产的缺陷。
第二阶段：干细胞球体的生长、活性和功能特征分析。 在球体形成过程中，研究人员在不同时间点（24、48、72小时）对其进行了动态监测。通过活/死细胞染色法（Live/Dead staining）评估细胞活性，发现细胞活性随培养时间呈上升趋势，从75.85%提升至91.9%。免疫荧光染色结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察显示，球体内部形成了有序的细胞层级和丝状肌动蛋白（filamentous actin）分布。为深入探究球体培养对干细胞功能的影响，研究者对培养72小时的干细胞球体和常规单层培养的ADSCs（对照组）进行了转录组测序分析（RNA-seq）。差异表达分析筛选出6480个差异表达基因（3534个上调，2946个下调）。基因本体论（GO）富集分析揭示，上调的差异基因显著富集于细胞外基质组构（extracellular matrix organization）、胰岛素样生长因子（IGF）受体信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）生成、趋化因子介导的信号通路以及平滑肌细胞增殖的正向调控等生物学过程。通过热图和定量聚合酶链式反应（qPCR）验证，研究者确认了与促血管生成（如PTGS2, IGF, PDGF-D, EREG）和细胞外基质生成（如COMP, COL14A1, DPT, COL5A3, JAM2）相关的关键基因在球体中显著高表达。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析进一步表明，这些基因可能通过cAMP信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等发挥功能。
第三阶段：MN@sps贴片的制备及其体外促血管生成功能评估。 在细胞球体成功生成后，研究者向微流控芯片通道内注入含光引发剂的HAMA预凝胶溶液，以缓慢流速完全置换培养基并填充微腔。随后，通过紫外光照射使HAMA固化，脱模后即获得每根微针尖端均包封有一个干细胞球体的MN@sps贴片。光学显微镜和荧光显微镜证实了其完好的针尖形态和负载的球体。体内穿透试验验证了该微针贴片能够有效穿透表皮层并到达真皮层。为评估MN@sps的体外生物学效应，研究人员制备了不同处理组的浸提液，与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）共培养。通过划痕实验、Transwell迁移实验、EdU增殖实验和管形成（tube formation）实验，系统考察了MN@sps浸提液对HUVECs迁移、增殖及体外成管能力的影响。结果显示，与其他对照组（单层干细胞、不含干细胞的微针等）相比，MN@sps浸提液能极显著地促进HUVECs的迁移、增殖，并形成最为丰富和完整的血管样网状结构。
第四阶段：在1型糖尿病小鼠模型体内验证MN@sps的伤口愈合疗效。 研究者通过腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin）构建1型糖尿病小鼠模型，并在小鼠背部双侧制造直径8mm的全层皮肤缺损创面。实验设置了六个处理组：PBS组、空白微针（MN）贴片组、单细胞悬液（ADSCs）组、干细胞球体悬浮液（SPs）组、负载单细胞的微针（MN@ADSCs）贴片组和负载干细胞球体的微针（MN@sps）贴片组。通过每3天记录伤口面积，并在第12天收集伤口组织进行组织学和免疫荧光分析，系统评价治疗效果。结果显示，MN@sps组在宏观伤口愈合速率上显著快于所有其他组。伤口面积追踪分析和愈合动力学曲线均证实了这一趋势。
研究取得了从体外到体内一致且逻辑递进的结果。首先，在球体制备阶段，微流控芯片成功生成了尺寸高度均一的干细胞球体，其直径稳定在150微米左右。这一结果直接回应了该领域对精准控制细胞球体尺寸的迫切需求。活/死染色显示的逐渐升高的细胞活性（最高达91.9%）和有序的细胞骨架结构，表明微流控环境不仅未损害细胞，反而促进了其向更高级的三维结构重组。
其次，转录组学分析的结果在分子层面深刻揭示了三维球体培养相对于二维单层培养的优越性。细胞外基质组构和VEGF生成相关基因的显著上调，为后续的体外促血管生成功能和体内组织修复提供了坚实的分子理论基础。具体而言，上调的PTGS2、IGF等基因是已知的血管生成强效促进因子，而COMP、胶原蛋白（COL）等基因的上调则预示了其促进细胞外微环境重建的强大潜力。这些基因表达谱的变化，合理地解释了该球体为何具备卓越的治疗潜能。
再次，体外HUVECs实验的结果完美地承接并证实了转录组学的发现。与MN@sps浸提液共培养的HUVECs展现出最强的迁移、增殖和成管能力，这直接证明了负载于微针内的干细胞球体可以通过其分泌组（secretome）发挥强大的促血管生成效应。这一功能性结果将基因表达的分子证据转化为可观测的生物学效应，逻辑链条清晰完整。
最终，体内动物实验是前面所有研究结果的终末验证与临床转化桥梁。MN@sps组具有最快的伤口闭合速度和最显著的新生组织厚度，这是宏观疗效的直接体现。更为关键的是，CD31免疫荧光染色定量分析显示，MN@sps组的伤口组织中新生微血管密度最高；同时，马松三色染色（Masson trichrome staining）表明该组的胶原沉积量也显著增多。这两个微观指标分别从血管重建和组织基质重塑两个核心维度，为快速伤口愈合提供了组织病理学解释。通过对比SPs悬浮液组与MN@sps贴片组，突显了微针作为载体在保护细胞活性、实现精准深层递送和维持局部有效浓度方面的关键作用；而对比MN@ADSCs组和MN@sps组，则无可辩驳地证明了干细胞球体这一三维形态在增强细胞功能和治疗效果上的决定性优势。
本研究得出结论：利用模板集成微流控芯片，可以高效、便捷地制备出负载均匀干细胞球体的微针贴片（MN@sps）。该平台整合了干细胞球体的三维培养优势和微针的精准递送优势。封装于微针内的干细胞球体保持了高活性和卓越的旁分泌功能，能够通过高表达促血管生成和细胞外基质组构相关基因，在体外显著促进内皮细胞的成血管行为，在体内则通过促进血管重建、胶原沉积和肉芽组织增生，实现对糖尿病慢性伤口的加速愈合。
这项研究的科学价值在于：它提出并验证了一种全新的“三维干细胞球体+微针递送”联合治疗理念，为工程化干细胞疗法提供了新的技术范式。其应用价值在于：为临床上治疗困难、易复发的糖尿病慢性伤口提供了一种精准、微创且高效的治疗新策略，具有巨大的转化医学潜力。
本研究的亮点主要体现在三个方面。第一，重要的发现：首次揭示了将微流控模板技术应用于原位生成并同步封装干细胞球体于微针中的可行性，并系统地证实了干细胞球体相对于单细胞在促进糖尿病伤口愈合上的显著优越性。第二，方法的创新性：成功设计并应用了一种兼具细胞球培养和微针成型功能的模板集成微流控芯片，它简化了传统多步骤操作的繁琐流程，避免了细胞转移损失和批次间差异，确保了质控的均一性。第三，研究对象的特殊性：聚焦于病理机制复杂、难愈合的糖尿病伤口模型，在此类疾病背景下验证了该新型治疗平台的卓越疗效，展现了其在再生医学修复领域的广阔前景。