本研究由集美大学水产学院的王天宇、林鹏、王艺磊、赖晓健、陈鹏云、李福燕及冯建军等人完成，其中冯建军为通讯作者。该研究成果发表于MDPI旗下的开放获取期刊《Animals》，文章于2023年9月10日在线发表，论文编号为Animals 2023, 13, 3157，DOI为10.3390/ani13193157。研究得到了福建省自然科学基金、福建省海洋生物培养与高值化利用重点实验室开放课题、教育部鳗鱼现代产业技术工程研究中心以及农业部东海海水健康养殖重点实验室等多个项目的资助。
本研究的学术背景属于鱼类免疫学与比较免疫学领域，重点关注硬骨鱼类I型干扰素（type I IFN）受体的免疫功能。在哺乳动物中，I型干扰素受体IFNAR1是宿主抵御病毒入侵的关键受体，其与干扰素结合后激活JAK/STAT信号通路，诱导Mx蛋白等抗病毒蛋白的表达。然而在硬骨鱼类中，IFNAR1的同源蛋白被称为CRFB5，其免疫学功能长期未被充分阐明。日本鳗鲡（Anguilla japonica）是东亚地区重要的水产养殖品种，但细菌性疾病和病毒性疾病的频繁暴发已造成重大经济损失，因此深入了解该物种的免疫调控机制对疾病防控具有重要意义。此前虽有研究表明鱼类CRFB5可被poly I:C刺激诱导表达，从而参与抗病毒免疫，但CRFB5是否也参与抗细菌免疫以及其调控的下游信号通路仍不清楚。为此，作者克隆了日本鳗鲡CRFB5A同源基因AjCRFB5A，并在体内外分别通过过表达和RNA干扰等手段，系统研究了其在I型干扰素信号通路及抗菌免疫中的作用。
在具体研究流程方面，本研究共包括基因克隆与生物信息学分析、组织表达与免疫刺激表达分析、亚细胞定位、双荧光素酶活性检测、基因过表达以及RNA干扰体内外功能验证等多个环节。研究对象为健康的日本鳗鲡，体重在40至45克之间，经循环水暂养两周后进行实验。在基因克隆环节，作者利用特异性引物和RACE技术获得了AjCRFB5A的全长cDNA序列，并提交至GenBank，登录号为MF537666。生物信息学分析采用Phyre2在线网站进行三维结构预测，利用MEGA 6软件构建系统发育树，并通过ExPASy和ClustalW等工具进行序列分析。结果显示，AjCRFB5A的cDNA全长1605 bp，编码422个氨基酸，包含两个纤连蛋白III型结构域（fibronectin-3 domains）和一个跨膜区（238–260 aa），其三维结构与斑马鱼、亚洲龙鱼以及人类的IFNAR1相似。系统发育分析表明，AjCRFB5A与其他硬骨鱼类的CRFB5聚为一支，而哺乳动物、鸟类和爬行动物的IFNAR1及IFNAR2则形成另一分支。在组织表达分析中，作者收集了健康鳗鲡的多种组织并提取总RNA，应用RT-qPCR检测AjCRFB5A的表达水平，发现其在所有检测组织中均有表达，其中肠道和肝脏表达最高，脾脏、鳃和肾脏次之，皮肤、心脏和肌肉表达较低。在免疫刺激实验中，日本鳗鲡分别腹腔注射嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，4 × 10^4 CFU/ml）、LPS（4 mg/ml）和poly I:C（2 mg/ml），对照组注射PBS，每组每个时间点取4尾鱼，在注射后0、6、12、24、48和72小时采集肝脏、脾脏和肾脏进行RT-qPCR检测。结果表明，嗜水气单胞菌感染后，肝脏中AjCRFB5A在6小时和48小时分别上调4.2倍和3.1倍，脾脏在48小时上调2.8倍；LPS刺激后，仅肝脏在6小时上调2.5倍；poly I:C刺激后，肝脏中AjCRFB5A在6、12、24和48小时分别上调3.4、5.3、4.1和4.6倍。在体外实验中，日本鳗鲡肝细胞经LPS、poly I:C、CpG-DNA和PGN刺激，仅poly I:C在12小时诱导AjCRFB5A上调3.4倍；嗜水气单胞菌感染则能以剂量和时间依赖性方式显著上调AjCRFB5A的表达。在亚细胞定位实验中，作者将EGFP-AjCRFB5A融合蛋白电转染至日本鳗鲡肝细胞，荧光显微镜观察发现该蛋白主要分布于细胞膜上，部分呈凝聚状态，与哺乳动物IFNAR1的膜定位特征一致。在双荧光素酶实验中，作者将pCDNA3.1his-AjCRFB5A与人类IFNβ、NF-κB荧光素酶报告质粒以及AjIFN3启动子共转染至HEK293细胞和FHM细胞，发现AjCRFB5A过表达能显著增强上述报告基因的活性，说明其能够激活I型干扰素和NF-κB信号通路。在基因过表达实验中，日本鳗鲡肝细胞转染pCDNA3.1his-CRFRB5A后，RT-qPCR检测显示IFN1、IFN2、IFN3、IFN4、IRF3、IRF5和IRF7的表达均显著上调。在RNA干扰实验中，作者合成了针对AjCRFB5A的dsRNA，体内以40 μg/尾的剂量腹腔注射日本鳗鲡，24小时后采集肝脏、脾脏、肾脏和肠道；体外则将dsRNA转染至日本鳗鲡肝细胞。结果显示，敲降AjCRFB5A后，上述I型干扰素信号通路相关基因以及抗菌肽LEAP2基因在体内外均发生显著下调。其中LEAP2在AjCRFB5A过表达时显著上调，在敲降后于肾脏、脾脏、肝脏、肠道和肝细胞中均显著下降。
综合以上结果，本研究得出以下结论：日本鳗鲡CRFB5A基因在全组织广泛表达，尤其在肝脏和肠道高表达；嗜水气单胞菌感染和poly I:C刺激均能显著诱导其表达，说明CRFB5A参与了宿主抗病毒和抗细菌双重免疫应答。机制上，AjCRFB5A通过激活IRF3和IRF7介导的I型干扰素信号通路，上调IFN1-4及IRF3、IRF5、IRF7的表达，从而正向调控宿主的抗病毒免疫；同时，AjCRFB5A还能通过上调抗菌肽LEAP2的表达参与抗细菌免疫。本研究首次在硬骨鱼类中通过体内外功能实验证明了CRFB5对I型干扰素信号通路的正向调控作用，并揭示了其在抗菌免疫中的新功能，为深入理解脊椎动物I型干扰素受体的免疫功能提供了新的实验证据。
本研究的亮点包括：一是首次在硬骨鱼类中通过RNA干扰和过表达相结合的手段，系统证明了CRFB5A对IRF3/IRF7介导的I型干扰素信号通路以及LEAP2抗菌肽表达的调控作用；二是首次在体内水平验证了鱼类CRFB5在抗细菌免疫中的功能，填补了以往仅在体外研究其与干扰素结合活性的空白；三是发现AjCRFB5A定位于细胞膜，且具有保守的纤连蛋白III型结构域和跨膜区，与哺乳动物IFNAR1在结构和功能上具有相似性，为比较免疫学研究提供了重要的模式蛋白。此外，该研究还提供了日本鳗鲡CRFB5A的全长cDNA序列及表达谱数据，为后续开展鳗鲡病害防控和免疫增强策略研究奠定了基础。