骨髓间充质干细胞分泌的抗炎蛋白TSG-6通过抑制脊髓小胶质细胞中的TLR2/MyD88/NF-κB信号通路减轻神经病理性疼痛

主要作者及发表信息

本研究由杨浩（Hao Yang）、吴灵敏（Lingmin Wu）等学者共同完成，其中杨浩和吴灵敏为共同第一作者。通讯作者为朱丽娜（Lina Zhu）和吕欣（Xin Lv）。研究团队主要来自同济大学医学院附属上海市肺科医院麻醉科。该研究成果于2020年发表于《Journal of Neuroinflammation》期刊（2020年第17卷，文章编号154），这是一本专注于神经炎症领域研究的开放获取（Open Access）期刊。

研究背景与目的

神经病理性疼痛是一种由躯体感觉神经系统原发性损伤或功能障碍引起的慢性致衰性疾病，其特征是对有害或无害刺激产生超敏反应。据估计，其影响高达10%的人口，且传统药物、神经阻滞、手术等疗法效果往往不理想。近年来，越来越多的证据表明，神经炎症和免疫系统在神经病理性疼痛的发生和维持中起着至关重要的作用。其中，脊髓背角中活化的小胶质细胞（Microglia）是导致疼痛的关键因素。激活的小胶质细胞形态会发生改变，并通过释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等促炎细胞因子来加剧疼痛。

骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）作为一种具有低免疫原性和强大免疫调节特性的多能干细胞，已被证实可通过旁分泌多种生物活性分子来缓解神经病理性疼痛。其中，TNF-α刺激基因6蛋白（TNF-α-stimulated gene 6 protein, TSG-6）是一种关键的抗炎蛋白，在调节炎症微环境中发挥重要作用。此前，研究团队已发现BMSCs分泌的TSG-6可通过抑制TLR2/MyD88/NF-κB通路延缓椎间盘退变。然而，BMSCs是否通过分泌TSG-6来发挥对神经病理性疼痛的镇痛作用尚不清楚。因此，本研究旨在评估BMSCs释放的TSG-6对慢性压迫性损伤（Chronic Constriction Injury, CCI）诱导的大鼠神经病理性疼痛的镇痛效果，并探索其在体内（in vivo）和体外（in vitro）可能的分子机制。

研究流程与实验方法详述

本研究分为体内动物实验和体外细胞实验两大部分，通过多层次的实验设计来系统地阐明BMSCs及其分泌的TSG-6缓解神经病理性疼痛的作用和机制。

第一部分：体内动物实验

1. 实验模型与核心治疗策略 研究采用成年雄性SD大鼠，通过坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI）手术建立经典的神经病理性疼痛模型。实验动物被随机分为多个组，包括假手术组（Sham）、CCI模型组（CCI + PBS）、以及不同剂量的BMSCs治疗组（CCI + BMSCs (5×10⁵)、CCI + BMSCs (1×10⁶)、CCI + BMSCs (5×10⁶)）。治疗方式是于CCI术后第1天，通过鞘内注射（Intrathecal injection）将BMSCs或对照溶剂PBS注入大鼠脊髓脑脊液中。为了验证TSG-6的特异性作用，研究还设置了基因沉默组，即向大鼠鞘内注射转染了TSG-6-shRNA（短发夹RNA）的BMSCs，以敲低（knock down）BMSCs中TSG-6的表达，并与注射了阴性对照shRNA（NC-shRNA）转染的BMSCs组进行比较。此外，为了确认TSG-6本身的镇痛足以缓解疼痛，另一批CCI大鼠在术后第7天被鞘内注射了外源性重组人TSG-6蛋白（rhTSG-6，剂量分别为1 μg和5 μg）。

2. 行为学评估与脊髓组织分析 术后第1、3、5、7、14天，研究者对大鼠进行了一系列行为学测试，以评估疼痛缓解效果和运动功能。使用动态足底触觉仪（Dynamic plantar aesthesiometer）测量机械性触诱发痛（Mechanical allodynia）的缩足阈值（Paw Withdrawal Threshold, PWT），使用哈格里夫斯法（Hargreaves apparatus）评估热痛觉过敏（Thermal hyperalgesia）的缩足潜伏期（Paw Withdrawal Latency, PWL）。同时，利用旋转棒系统（Rotarod system）评估大鼠的运动协调能力，以排除药物对运动功能的影响。

为探究作用机制，研究在手术后不同时间点取大鼠脊髓腰膨大段（L4-L5）组织进行分子生物学分析。通过实时定量PCR（Real-time RT-PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测脊髓背角中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA及蛋白表达水平。通过蛋白免疫印迹（Western blot）和免疫荧光（Immunofluorescence）染色检测小胶质细胞标志物Iba-1的表达，以评估小胶质细胞的活化程度。更为关键的是，为了揭示信号通路机制，研究同样利用Western blot和免疫荧光技术，检测了脊髓背角组织中TLR2/MyD88/NF-κB信号通路关键蛋白TLR2、MyD88、以及磷酸化p65（p-p65）的表达水平。同时，通过免疫荧光双标染色，观察了TLR2在神经元（NeuN）、星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（Iba-1）上的共定位情况。为了追踪移植的BMSCs，研究使用了CM-Dil染料标记细胞，并在注射后第3天观察其在脊髓背角的分布。

第二部分：体外细胞实验

1. 细胞培养与共培养模型 研究者从新生SD大鼠大脑皮层分离并纯化原代小胶质细胞（Primary microglia），经免疫染色鉴定纯度约97%。同时，从大鼠骨髓中分离、培养BMSCs，通过流式细胞术鉴定其特异性表面标志物（CD29、CD90、CD105阳性；CD45、CD34、CD11b阴性），并成功诱导其分化成骨、软骨和脂肪细胞，确认其多向分化潜能。

2. 机制验证实验 为了在体外模拟并验证体内发现，研究使用了Transwell共培养系统。首先，使用TLR2特异性激动剂（TLR2 agonist）Pam3CSK4（400 ng/ml）刺激原代小胶质细胞1小时以激活炎症通路。然后将这些活化的细胞置于下层小室，将不同处理的细胞或试剂置于上层小室共培养24小时。共培养设置包括：(1) 空白对照组；(2) 正常BMSCs组；(3) 转染了TSG-6-shRNA的BMSCs组；(4) 转染了NC-shRNA的BMSCs组；(5) 不同浓度（200、400、600 ng/ml）的重组人TSG-6蛋白组。共培养结束后，利用Western blot检测小胶质细胞中TLR2、MyD88、p-p65的蛋白表达；利用ELISA检测培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平；并利用免疫细胞化学染色（Immunocytochemistry）观察NF-κB p65亚基的核转位（Nuclear translocation）情况。

主要研究结果

1. BMSCs有效缓解CCI诱导的神经病理性疼痛 行为学结果显示，与假手术组相比，CCI模型组大鼠在术后第1天即表现出明显的机械性触诱发痛和热痛觉过敏，并持续至第14天。单次鞘内注射BMSCs可剂量依赖性地显著提高大鼠的缩足阈值和缩足潜伏期，表明BMSCs能有效缓解疼痛，且该镇痛效果可持续至少14天。旋转棒测试显示BMSCs治疗对大鼠运动功能无显著影响。此外，示踪实验显示，CM-Dil标记的BMSCs在鞘内注射后第3天主要分布在同侧脊髓背角，证实了移植细胞的归巢和存活。

2. BMSCs通过抑制神经炎症缓解疼痛 CCI术后，大鼠同侧脊髓背角中的促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的mRNA和蛋白水平显著增加，小胶质细胞标志物Iba-1的表达也显著上调，并在第7天达到高峰。免疫组化分析显示，小胶质细胞从静息状态的分支状形态转变为活化的阿米巴样形态。而鞘内注射BMSCs（5×10⁶）能够显著逆转这些变化，降低促炎因子水平，抑制Iba-1的表达，并减少活化态小胶质细胞的数量。

3. TSG-6是BMSCs发挥镇痛和抗炎作用的关键因子 通过转染TSG-6-shRNA成功敲低BMSCs的TSG-6表达后，其镇痛效果被大幅削弱。行为学测试中，注射TSG-6敲低的BMSCs对机械性痛觉异常和热痛觉过敏的缓解作用远不如注射正常BMSCs或NC-shRNA-BMSCs。同时，TSG-6敲低也使得BMSCs对小胶质细胞活化的抑制作用显著减弱。更为重要的是，直接鞘内注射外源性重组TSG-6蛋白也能剂量依赖性地快速缓解CCI大鼠的疼痛行为，并在注射后3小时显著降低脊髓中促炎细胞因子的蛋白水平。

4. TSG-6通过抑制小胶质细胞中的TLR2/MyD88/NF-κB信号通路发挥抗炎作用 体内研究证实，CCI手术导致大鼠脊髓背角中TLR2、MyD88和p-p65蛋白水平显著升高。鞘内注射BMSCs可有效抑制该通路的激活，而敲低TSG-6后这种抑制效果被消除。免疫荧光双标结果明确显示，TLR2在CCI术后的脊髓背角中几乎仅表达于小胶质细胞上，而不与星形胶质细胞或神经元共定位。体外细胞实验进一步验证了该机制：Pam3CSK4刺激显著激活了原代小胶质细胞中TLR2/MyD88/NF-κB信号通路，并促进了p65亚基的核转位以及下游IL-1β、IL-6、TNF-α的大量释放。与正常BMSCs或不同浓度的重组TSG-6共培养，则能浓度依赖性地抑制该通路蛋白的表达、减少p65的核转位并降低促炎因子的分泌。同样，敲低BMSCs中的TSG-6显著削弱了其对该通路的抑制能力。

研究结论与价值

本研究首次证明了鞘内注射BMSCs可以通过旁分泌机制，即分泌抗炎蛋白TSG-6，来发挥对神经病理性疼痛的持续镇痛作用。其核心机制在于，TSG-6能够靶向抑制脊髓背角小胶质细胞中TLR2/MyD88/NF-κB信号通路的活化，进而减少下游促炎细胞因子的产生，最终达到神经保护和缓解疼痛的效果。此外，研究还证明了鞘内注射外源性重组TSG-6蛋白可以作为治疗CCI诱导的神经病理性疼痛的一种有效选项。

该研究的科学价值在于，它从一个新颖的角度解释了BMSCs治疗神经病理性疼痛的分子机制，即通过分泌TSG-6直接作用于小胶质细胞的TLR2受体及其下游通路来发挥即时且强大的抗炎和镇痛作用。这一发现将BMSCs的旁分泌作用、TSG-6的抗炎功能以及TLR2通路在神经病理性疼痛中的关键角色三者有机地联系起来，为理解细胞治疗如何调控神经免疫微环境提供了新的理论依据。在应用价值层面，该研究为开发基于TSG-6的生物制剂或基因工程改造的BMSCs来治疗慢性疼痛提供了坚实的实验基础，提示TSG-6本身可能成为一种新型、高效的镇痛药物靶点或生物治疗分子。

研究亮点

本研究的主要亮点可归纳为以下三点：第一，明确的因果机制阐明：通过shRNA基因沉默技术，本研究清晰地将BMSCs的镇痛作用归因于TSG-6这一单一分子，并在体内和体外实验中反复验证，证据链完整且极具说服力。第二，精准的治疗靶点定位：研究不仅揭示了TSG-6的作用，还精确地将其靶点定位于脊髓背角的小胶质细胞，并阐明了具体的TLR2/MyD88/NF-κB信号通路，这为未来针对特定细胞类型的精准治疗指明了方向。第三，比较性的治疗策略验证：研究直接对比了BMSCs和重组TSG-6蛋白的治疗效果，发现BMSCs能提供更长久的疼痛缓解，这巧妙地从侧面印证了活细胞能响应炎症微环境、持续分泌治疗因子的独特优势，为干细胞疗法相对于单一蛋白治疗的优越性提供了证据支持。