武汉大学医学病毒学研究所病毒学国家重点实验室的J.-L. Li, J.-X. Ling, L.-J. Chen, F. Wei, F. Luo, Y.-Y. Liu, H.-R. Xiong, W. How, Z.-Q. Yang 等研究人员在 Intervirology 期刊上于2013年1月9日在线发表了一篇原创研究论文，题为《通过乳鼠连续传代分离汉滩病毒的一种高效方法》。本研究旨在解决汉坦病毒（特别是汉滩病毒，Hantaan virus, HTNV）从其自然宿主中分离困难这一长期存在的技术难题，并探索一种稳定高效的病毒分离策略，以期为后续研究不同病毒谱系的生物学特性（如毒力、致病性等）提供可靠的病毒来源。

本研究的学术背景建立在汉坦病毒对人类健康构成严重威胁这一事实之上。汉坦病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，是一种三节段负链RNA病毒，可引起人类严重的疾病，其中旧大陆汉坦病毒（主要分布在亚洲和欧洲）导致肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS），而新大陆病毒（主要分布在美洲）则引起汉坦病毒肺综合征。在中国，汉滩病毒是引起HFRS的主要病原体之一，其自然宿主为黑线姬鼠（Apodemus agrarius）。尽管基于基因组序列分析，中国的HTNV已至少被分为9个不同的遗传谱系，但由于从自然界宿主（如鼠类）中分离活病毒的难度极大，导致对这些不同谱系病毒的生物学特性研究严重滞后。传统的病毒分离方法，如使用Vero E6细胞，不仅效率不高，而且在细胞传代过程中，病毒基因组可能发生累积突变，从而改变其原始特性。因此，开发一种能够有效保持病毒原始状态并实现高效分离的方法至关重要。基于前期研究已知新生（乳）小鼠对HTNV感染高度敏感并可能致死，本研究团队旨在评估并建立一种利用乳鼠连续传代来分离和扩增汉滩病毒的方法。

本研究详细的工作流程包含多个紧密衔接的步骤，从样本筛选到最终的病毒特性分析，形成了一套完整的病毒分离与鉴定体系。具体流程如下：首先，样本收集与筛选。研究人员从中国湖北省江夏区（一个HFRS流行区）捕获黑线姬鼠，采集其肺组织。通过定量实时PCR（quantitative real-time PCR）方法对采集的样本进行汉坦病毒S基因片段筛查，以确定感染了汉坦病毒的阳性样本。其次，病毒分离与连续传代。这是本研究的核心操作流程。研究人员选取一份S基因片段呈阳性的黑线姬鼠肺组织，将其制成10%（重量/体积）的组织匀浆悬液。经过冻融和离心处理后，取上清液，通过颅内接种的方式，注射给新生（约72小时龄）的BALB/c乳鼠。在首次接种（第一代传代）后，研究人员持续观察小鼠的临床症状长达30天。之后，采集出现临床症状或到达观察终点的小鼠的脑、心、肺、肾等组织，利用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay, IFA）和RT-PCR检测病毒抗原及核酸，以确认感染。为了扩增病毒，他们将上一代感染阳性小鼠（本研究中使用的是脑组织）的组织匀浆，作为接种物，继续颅内接种给下一批新生BALB/c乳鼠，以此方式进行连续传代。本研究共完成了连续三次传代，每一代使用约6-8只乳鼠。所有动物操作均在武汉大学动物研究中心的动物生物安全三级实验室进行。第三，病毒检测与鉴定。在每一次传代过程中及传代结束后，研究人员运用了多种技术手段对病毒进行全面的鉴定。1. 间接免疫荧光法（IFA）：使用针对HTNV/76-118株的兔源抗体作为一抗，检测小鼠肺和脑组织冰冻切片中的病毒抗原，以定位病毒在组织中的分布。2. 定量实时PCR：提取不同组织（心、脑、肺、肾）的总RNA，通过特异性引物和探针检测病毒S基因片段的拷贝数，并以小鼠GAPDH mRNA作为内参进行标准化，从而准确定量不同器官和组织中的病毒载量，评估病毒在宿主体内的复制动态。3. 透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）：取第三代感染小鼠的脑组织进行固定、包埋、超薄切片和染色，在电镜下直接观察病毒粒子的形态和大小。第四，病毒基因组测序与遗传分析。为了评估病毒在传代过程中是否发生显著遗传变异，研究人员分别对第一代和第三代传代后获得的病毒（命名为HV004株）进行了全基因组（S、M、L三个片段）测序。他们使用特异性引物进行RT-PCR扩增，并通过RNA连接法确定基因组的末端序列。随后，他们利用ClustalX、BioEdit等软件进行序列比对，并使用MEGA软件构建系统发育树，确定HV004株的基因分型，并仔细比对第一代与第三代病毒基因组序列的差异，寻找可能的核苷酸突变。本研究的特别之处在于，它系统地采用了乳鼠体内传代这一经典的病毒分离策略，并将其与现代分子生物学技术（如定量PCR、高通量测序）和形态学技术（电镜）相结合，形成了一套从分离、扩增到全面鉴定的高效、标准化流程。研究流程中没有使用全新的、独创的软硬件或算法，但通过严谨的实验设计和多种技术的组合应用，确保了结果的可靠性和结论的稳健性。数据分析工作流主要包括对定量PCR数据的统计比较、病毒载量在不同器官和不同传代间的变化趋势分析，以及对基因组序列进行比对和系统发育分析。

本研究的主要结果详尽地回答了关于分离方法有效性和病毒特性的核心问题。首先，病毒分离与传代结果。将阳性鼠肺匀浆接种乳鼠后，在第一代传代中，虽然30天内没有小鼠死亡，但通过RT-PCR在1/7的小鼠的多个器官（心、脑、肺、肾）中检测到了病毒S基因片段，证明了病毒可以在乳鼠体内建立感染。在第二代传代中，感染情况显著加剧：1/6的小鼠在接种后16天死亡，其余小鼠均表现出明显的临床症状（体重减轻、活动减少、毛发竖立），并且所有6只接种鼠的脑和肺组织均通过IFA检测到病毒抗原，RT-PCR也在所有鼠体内检测到病毒S基因片段。到了第三代传代，病毒毒力进一步增强：小鼠在接种后约10天出现明显的体重下降，并在13-14天全部死亡，死亡前出现后肢麻痹等严重神经系统症状。RT-PCR在所有7只小鼠的脑、心、肺、肾组织中均检测到病毒RNA，IFA也在脑和肺组织中观察到散在的、颗粒状的特异性荧光信号。这些结果连续性地证明，通过乳鼠连续传代，病毒不仅能够成功地从原始宿主材料中分离出来，而且在传代过程中其感染性和致病力在乳鼠模型中得到了有效的维持和增强，最终成功分离到一株被命名为HV004的汉坦病毒株。其次，病毒载量分析结果。定量实时PCR的数据清晰地揭示了病毒在宿主体内的复制动态和传代效应。随着传代次数的增加（从第一代到第三代），病毒在关键靶器官中的载量显著上升。具体而言，在脑组织中，病毒RNA拷贝数/纳克GAPDH mRNA从第一代的477增加到了第三代的7,278；在肺组织中，则从46增加到了4,898。无论是在同一代内进行横向比较，还是对不同传代进行纵向比较，脑组织中的病毒载量始终最高，其次是肺组织，而心脏和肾脏中的病毒载量相对较低且增长幅度较小。这一结果不仅证实了病毒在乳鼠体内（特别是神经系统）的有效复制，也证明了连续传代是富集和扩增病毒的一种高效方法，为后续研究提供了高滴度的病毒材料。第三，病毒形态学鉴定结果。透射电子显微镜观察为HV004株的存在提供了最直接的形态学证据。在第三代感染乳鼠的脑组织超薄切片中，研究人员观察到了具有双层包膜的、直径在91.8至117.82纳米之间的病毒样颗粒。这一大小和形态特征与已知的汉坦病毒描述完全吻合，从而从形态上确认了分离物确实是汉坦病毒颗粒。第四，病毒遗传稳定性分析结果。这是评估分离方法是否“保真”的关键。研究人员对第一代和第三代HV004株进行了全基因组测序和比对。系统发育分析表明，HV004株属于汉坦病毒，并且是一个新的亚型。更重要的是，序列比对结果显示，在从第一代传到第三代的过程中，病毒在整个S、M、L基因组的编码区均未发生任何核苷酸替换。唯一的一个变化是在S片段的3‘端非编码区（3’-non-coding domain）的第1392位点发生了一个单核苷酸交换（从G变为A）。这一发现具有极其重要的意义：它表明通过乳鼠连续传代的方法分离和扩增病毒，在三次传代内能高度保持病毒基因组的稳定性，最大限度地保留了从自然宿主中获得的病毒的原始遗传特征，避免了在细胞培养中常见的适应性突变积累问题。这些结果之间存在清晰的逻辑关系：成功的初始感染（第一代PCR阳性）为连续传代奠定了基础；传代过程中临床症状的出现和加剧（第二代、第三代），以及病毒载量的显著升高，共同证明了该分离方法的有效性；电镜观察提供了病毒存在的直接证据；而基因组稳定性分析则证明了该方法在保持病毒原始遗传信息方面的优越性，所有这些结果共同指向并支持了研究的最终结论。

本研究的结论明确且具有重要意义。研究表明，将疑似感染汉坦病毒的啮齿动物样本接种乳鼠并进行连续传代，是分离汉滩病毒的一种高效、可靠的方法。该方法能够使病毒在乳鼠的靶器官（尤其是脑和肺）中高效复制和扩增，并且在有限的传代次数内（本研究中为三次）能很好地保持病毒基因组的稳定性，从而最大限度地保留了病毒从自然宿主中获得的最初状态。这种方法克服了传统细胞培养分离汉坦病毒效率低且易引入突变的问题，为获取更接近自然界原始状态的汉坦病毒毒株提供了一条可行的技术路径。因此，该研究不仅提供了一种实用的病毒分离技术方案，更重要的科学价值在于：它使得后续对在中国流行的不同HTNV及首尔病毒（Seoul virus, SEOV）谱系的生物学特性（如毒力差异、致病机制、与宿主免疫系统的相互作用等）进行深入研究成为可能。研究人员可以应用此方法从不同地区、不同谱系的自然宿主中分离活病毒，建立病毒库，从而为比较病毒学、疫苗研发、抗病毒药物筛选等应用研究奠定坚实的物质基础。

本研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先，研究方法的有效性与创新性结合。虽然使用乳鼠分离病毒并非全新概念，但本研究系统性地验证了其在分离HTNV方面的效率，并将其与完整的鉴定流程相结合，形成了一套标准化方案。其次，重要的发现：研究不仅成功分离出一株新的HTNV亚型（HV004），更重要的是通过全基因组测序对比，提供了强有力的证据，证明乳鼠传代法在保持病毒遗传稳定性方面优于细胞培养法（仅S片段3‘UTR发生一个点突变），这是一个关键的优势。第三，详细的过程与数据支撑：研究提供了从临床症状、组织病理（IFA）、病毒载量定量、病毒形态到遗传分析的完整数据链，论证充分、逻辑严谨。定量PCR数据清晰地展示了病毒在传代过程中的扩增动态和器官嗜性（嗜神经性为主），这些数据对于理解HTNV在动物模型中的致病过程也很有价值。第四，明确的应用前景：作者明确指出，该方法不仅适用于HTNV，也可能推广用于分离其他啮齿动物相关的汉坦病毒，这为全球汉坦病毒研究的资源获取提供了新思路。

此外，本研究还有其他有价值的内容。例如，文中讨论了动物模型的选择依据，指出BALB/c小鼠（来源于小家鼠Mus musculus）与HTNV的自然宿主黑线姬鼠（Apodemus）的亲缘关系较近，可能比使用更远缘的动物（如仓鼠）具有更高的敏感性，这为方法学提供了理论依据。同时，研究也观察到，由于采用颅内接种途径，分离株HV004在脑组织中的病毒载量最高，这与某些通过皮下接种的毒株（如HTNV 76-118）在肺组织中滴度更高的现象不同，提示接种途径可能影响病毒的体内分布和器官嗜性，这是在解释和比较不同研究结果时需要考虑的因素。