本研究是一项原创性研究，发表于《Cell Reports》期刊，时间为2024年12月24日（第43卷第12期，文章号114982）。主要作者为Guoqiang George Sun（孙国强）和Cheng Wang（王成），他们与Randall C. Mazzarino、Paula Andrea Perez-Corredor、Hayk Davtyan、Mathew Blurton-Jones、Francisco Lopera、Joseph F. Arboleda-Velasquez、Yanhong Shi（石彦红）等人共同完成了此项工作。通讯作者为Yanhong Shi。研究机构包括希望之城贝克曼研究所神经退行性疾病系、麻省眼耳医院Schepens眼科研究所及哈佛医学院眼科系、加州大学欧文分校神经生物学与行为学系、哥伦比亚安蒂奥基亚大学神经科学组等。

该研究属于神经科学和阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）研究领域。其学术背景源于对AD发病机制和潜在治疗策略的持续探索。AD是最普遍的神经退行性疾病，其特征是细胞外淀粉样斑块（amyloid plaques）和神经元内tau蛋白缠结（tau tangles）。载脂蛋白E（Apolipoprotein E, APOE）是大脑中主要的胆固醇载体，其ε4等位基因是AD最强的遗传风险因素。近年来，研究人员在携带早发性家族性AD致病突变（PSEN1 E280A）的一个特殊病例（患者α）中发现，尽管其脑内存在大量淀粉样斑块，但tau病理发展和认知障碍的发作却显著延迟。全外显子测序揭示该个体是APOE3克里斯教堂变体（APOE3 Christchurch，简称APOE3-Ch）的纯合子携带者。这一现象强烈暗示APOE3-Ch变体可能具有神经保护作用，但其因果机制尚不明确。因此，本研究的目的是利用基于人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）的先进模型，深入探究APOE3-Ch变体，特别是表达该变体的小胶质细胞（microglia），在AD病理中的保护作用及其分子机制。

研究的详细工作流程系统地结合了二维共培养和三维类器官模型。首先，研究团队构建了等基因的细胞系。他们通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，将两个对照APOE3 iPSC系编辑为APOE3-Ch iPSC系，并从杰克逊实验室获得了一对现成的等基因APOE3/APOE3-Ch iPSC系。此外，还使用了来自患者α（纯合APOE3-Ch，PSEN1 E280A突变被校正为野生型）和患者ω（纯合APOE3，PSEN1 E280A突变被校正为野生型）的iPSC系。同时，他们通过CRISPR-Cas9在对照iPSC中引入了PSEN1 E280A突变，用于模拟家族性AD的神经元表型。其次，从这些iPSC中分化产生小胶质细胞和神经元。小胶质细胞的分化遵循已发表的为期约35天的两阶段方案，神经元则使用团队已发表的方法进行分化。第三，建立核心实验模型：1）神经元-小胶质细胞共培养模型：将分化的APOE3或APOE3-Ch小胶质细胞与野生型或PSEN1突变神经元以一定比例共培养。2）神经免疫类器官模型：将小胶质细胞引入由野生型或PSEN1突变iPSC分化而来的大脑类器官中，模拟体内三维脑环境下的细胞互作。第四，施加病理刺激并进行表型分析。研究使用了多种AD相关病理刺激物，包括：合成的Aβ42肽段、从PSEN1突变神经元收集的条件培养基、从AD患者死后脑组织提取的tau寡聚体（oligomeric tau, oTau）以及AD患者脑源性突触体（AD human synaptosomes, ADHS）。将这些刺激物分别施加到上述共培养体系或小胶质细胞单独培养体系中。第五，采用多种技术进行多层次分析：通过免疫磁珠分选共培养后的小胶质细胞进行RNA测序（RNA-seq）以分析差异表达基因和通路；使用Phrodo标记的突触体或oTau进行吞噬功能检测；使用LipidSpot染料和Bodipy C11染料分别检测脂滴形成和脂质过氧化水平；通过免疫荧光染色和Western blotting检测神经元内磷酸化tau（phosphorylated tau, ptau）和总tau蛋白水平；利用多电极阵列（Multi-Electrode Array, MEA）记录神经元网络的电生理活动；使用铁死亡抑制剂（Liproxstatin-1）或诱导剂（过表达转铁蛋白受体TFRC）进行功能挽救或恶化实验；应用APOE模拟肽（133-149氨基酸）来模拟APOE3-Ch的保护效应。第六，数据分析：统计比较主要采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验，或双尾学生t检验。

研究取得了一系列相互印证的重要结果，逐步揭示了APOE3-Ch小胶质细胞的保护机制。在共培养模型中，当与PSEN1突变神经元共培养时，APOE3小胶质细胞的吞噬功能显著下降，而APOE3-Ch小胶质细胞则保持了强大的吞噬能力，且其炎症反应（IL-1β水平）也更低。这表明APOE3-Ch小胶质细胞对毒性环境更具抵抗力。RNA-seq分析为机制探索提供了关键线索。与APOE3小胶质细胞相比，APOE3-Ch小胶质细胞中与吞噬作用相关的基因（如ANXA3, CD93）表达上调，而与炎症反应、铁死亡（ferroptosis）、脂质代谢（如ACSL1）和AD相关的通路基因表达下调。这一发现将研究焦点引向了脂质代谢和铁死亡。后续实验证实了这一关联。当用Aβ42或PSEN1突变神经元条件培养基处理时，APOE3小胶质细胞出现了显著的脂滴积累、脂质过氧化以及铁死亡关键基因TFRC表达上调，而APOE3-Ch小胶质细胞则对这些诱导作用表现出抵抗。更重要的是，Aβ42诱导的脂质过氧化和铁死亡直接损害了APOE3小胶质细胞的吞噬功能及其存活率，使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1可以挽救其吞噬功能。相反，诱导TFRC过表达则损害了APOE3-Ch小胶质细胞的吞噬功能。这些结果清晰地证明，APOE3-Ch通过抵抗Aβ诱导的铁死亡，从而保持了小胶质细胞的吞噬功能。那么，增强的吞噬功能是否带来了直接的神经保护效果呢？答案是肯定的。当在共培养体系中加入外源性AD患者脑源性oTau或ADHS（作为病理性tau来源）后，与APOE3小胶质细胞共培养的神经元（无论是野生型还是PSEN1突变型）内积累了大量的ptau蛋白。然而，与APOE3-Ch小胶质细胞共培养的神经元中，ptau水平显著降低，表明APOE3-Ch小胶质细胞能更有效地清除这些毒性tau物种。这种保护作用具有功能相关性：MEA记录显示，ADHS处理会严重破坏与APOE3小胶质细胞共培养的神经元网络活动，但与APOE3-Ch小胶质细胞共培养的神经元网络活动则得到了很好的维持。研究进一步将发现拓展至更接近生理的三维模型。在PSEN1突变大脑类器官中引入小胶质细胞后，APOE3-Ch小胶质细胞比APOE3小胶质细胞能更有效地降低类器官中的ptau水平。最后，研究探索了潜在的治疗转化策略。已知APOE3-Ch的保护作用部分源于其对肝素硫酸蛋白聚糖（HSPG）等受体的亲和力降低。研究使用一种可阻断APOE与其受体相互作用的APOE模拟肽处理APOE3小胶质细胞，发现该肽段能够模拟APOE3-Ch的保护表型：减轻Aβ诱导的脂滴形成、脂质过氧化和吞噬功能损伤，并在ADHS挑战下降低神经元内的ptau水平。这一发现为开发基于APOE的疗法提供了直接线索。

本研究的结论是，在基于hiPSC的AD模型中，携带APOE3克里斯教堂变体的小胶质细胞通过一种新的机制发挥神经保护作用：它们能够抵抗Aβ42诱导的脂滴积累、脂质过氧化和随后的铁死亡，从而维持其正常的吞噬功能。这种增强的吞噬能力使得它们能够更有效地清除病理性tau蛋白（如oTau和ADHS来源的tau），阻止tau病理在神经元间的传播，最终保护神经元免受tau积累和神经网络活动失调的损害。这项研究不仅证实了APOE3-Ch变体在AD中的因果性保护作用，阐明了其作用机制（连接了Aβ毒性、小胶质细胞铁死亡、吞噬功能障碍和tau病理等多个AD核心环节），而且开发了可用于药物筛选的2D和3D人类细胞模型平台。更重要的是，APOE模拟肽能够成功模拟APOE3-Ch效应的发现，为开发以APOE为靶点、通过调节小胶质细胞脂质代谢和吞噬功能来治疗AD的新型疗法提供了强有力的理论依据和可行的策略方向。

本研究的亮点突出体现在多个方面。首先是重要的科学发现：首次在人类细胞模型中详细阐明了APOE3-Ch变体通过保护小胶质细胞免受铁死亡、从而维持其吞噬功能和tau清除能力的具体分子通路，填补了该领域的关键知识空白。其次是研究方法的创新性：巧妙地整合了等基因iPSC编辑、二维神经元-小胶质细胞共培养、三维神经免疫类器官等多种前沿技术，构建了一个层次丰富、高度可控的人类AD病理研究体系。特别是将小胶质细胞引入大脑类器官构建“神经免疫类器官”，能更好地模拟体内脑微环境中的细胞互作。第三是研究发现的转化潜力：不仅揭示了机制，还通过APOE模拟肽实验直接验证了一条可行的治疗转化路径，将基础研究发现快速导向了潜在的治疗应用探索。此外，研究还具有模型平台的拓展价值：所建立的平台可用于系统研究其他常见或罕见APOE变体（如APOE2, APOE4, APOE3-Jacksonville等）的风险或保护机制，并为筛选靶向APOE及其下游通路（抑制脂滴形成、脂质过氧化、铁死亡，增强吞噬作用）的AD治疗药物提供了强有力的工具。