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关于卢约病毒（Lujo Virus）入侵抑制剂筛选与鉴定的研究报告

本研究由中国科学院武汉病毒研究所病毒学国家重点实验室、中国科学院大学、南开大学药学院及药物化学生物学国家重点实验室、华中师范大学化学学院的研究人员共同完成。主要作者包括曹俊元、董思琪、刘洋、周敏敏、郭娇、贾晓莹、张悦丽、侯玉霞、田明、肖庚富（通讯作者）和王薇（通讯作者）。研究成果以题为《Screening and identification of Lujo virus entry inhibitors from an FDA-approved drugs library》的原创研究文章形式，发表于2021年12月2日的期刊《Frontiers in Microbiology》第12卷，文章ID为793519。

一、 研究背景与目的

本研究的科学领域聚焦于病毒学，特别是高致病性沙粒病毒（Arenaviridae）的防治策略。卢约病毒（Lujo virus, LUJV）是沙粒病毒科哺乳动物沙粒病毒属（Mammarenavirus）的成员，于2008年在赞比亚和南非首次发现，是卢约出血热（Lujo hemorrhagic fever, LUHF）的病原体。与拉沙病毒（LASV）、胡宁病毒（JUNV）等其他致病性哺乳动物沙粒病毒一样，LUJV被归类为生物安全四级（BSL-4）病原体。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）尚未批准任何针对LUJV或其他致病性旧世界（Old World）哺乳动物沙粒病毒的特异性药物或疫苗。

病毒入侵是病毒生命周期中的关键起始步骤，针对此环节的抑制剂能够早期阻断病毒感染和传播。LUJV的包膜糖蛋白复合体（Glycoprotein Complex, GPC）在病毒入侵过程中扮演核心角色，负责与宿主细胞受体结合并介导膜融合。GPC由稳定的信号肽（SSP）、受体结合亚基GP1和膜融合亚基GP2组成，其中SSP与GP2形成的界面被认为是沙粒病毒入侵的“阿喀琉斯之踵”，是设计抑制剂的理想靶点。此外，药物再利用（Drug repurposing）策略能够加速针对新发和再现病原体的药物发现进程，因为已获批药物的安全性、药代动力学和机制已有深入研究。

因此，本研究旨在通过高通量筛选FDA已批准药物库，寻找能够抑制LUJV入侵的候选化合物，阐明其作用机制，并评估其对其他致病性沙粒病毒的广谱抗病毒活性，从而为LUJV及其他相关病毒感染的潜在治疗提供候选药物和新的见解。

二、 研究详细流程

本研究包含多个紧密衔接的实验环节，主要流程如下：

1. 构建筛选平台与条件优化：由于LUJV需要在BSL-4实验室操作，研究团队首先构建了可在BSL-2条件下安全使用的重组病毒工具。他们利用水疱性口炎病毒（VSV）骨架，构建了携带LUJV GPC并表达绿色荧光蛋白（GFP）的复制能力型重组病毒（LUJVRV），以及仅携带LUJV GPC的假型病毒（LUJVPV）。这些工具病毒模拟了LUJV的入侵特性。研究人员在96孔板中对VERO细胞的接种密度和LUJVRV的感染剂量进行了优化，最终确定了每孔1.5×10⁴个细胞和1.5×10² PFU（空斑形成单位）的感染剂量。在此条件下，筛选实验的变异系数（CV）和Z’因子分别达到4.21%和0.95%，表明该高通量筛选（HTS）体系稳定可靠。

2. 高通量筛选（HTS）FDA药物库：研究从Selleck公司购买了包含1775种FDA批准药物的化合物库。筛选流程分为三步：

   • 初筛：在VERO细胞中，使用10 µM浓度的化合物预处理1小时后，以0.1的感染复数（MOI）感染LUJVRV。感染23小时后，固定细胞并用DAPI染色。使用Operetta高内涵成像系统对每孔9个视野进行成像，通过Harmony软件计算感染细胞（GFP阳性）占DAPI阳性细胞的百分比。将抑制率大于90%且无明显细胞毒性的145种化合物（8.17%）确定为初级候选物。
   • 反筛选：为了排除那些抑制VSV基因组复制（即作用于病毒骨架而非LUJV GPC）的化合物，研究人员用携带VSV自身糖蛋白的重组病毒（VSVRV）测试了上述145种初级候选物。筛选出对VSVRV抑制率小于10%（在25 µM浓度下）的21种化合物（1.18%）。
   • 剂量依赖性验证：对这21种化合物进行更广浓度范围（0.024–75.0 µM）的剂量-效应测试。最终，4种化合物（0.23%）显示出浓度依赖性的抑制效果。其中，曲美替尼（Trametinib）、马尼地平（Manidipine）和乐卡地平（Lercanidipine）这三种化合物因效果显著且细胞毒性较低，被选为“命中化合物”（hit compounds）进行后续深入研究；奥培米芬（Ospemifene）因细胞毒性被排除。

3. 体外抗病毒活性与细胞毒性评估：使用LUJVPV在VERO细胞上测定三种命中化合物的半数抑制浓度（IC50）和半数细胞毒性浓度（CC50），并计算选择性指数（SI = CC50/IC50）。同时，在VERO和A549两种细胞系上使用LUJVRV验证了它们的抗病毒效果，并计算了90%抑制浓度（IC90）。为确保结果可靠性，研究人员从其他商业来源重新购买了这三种化合物进行验证，结果与初筛一致。

4. 作用机制探究——膜融合抑制实验：为了探究化合物是否通过靶向GPC介导的膜融合过程发挥作用，研究建立了一个基于细胞-细胞融合（合胞体形成）的膜融合实验体系。将编码LUJV GPC、表面定位的CD63突变体（CD63GY234AA）和EGFP的质粒共转染到293T细胞中。在酸性pH（5.0）触发下，GPC发生构象变化，介导表达GPC的细胞与表达CD63的细胞发生融合，形成多核的合胞体。通过光学显微镜观察并利用ImageJ软件量化合胞体的大小，评估化合物对膜融合的抑制效果。

5. 病毒靶点鉴定——耐药突变株筛选：为了确定化合物的作用靶点是否为病毒蛋白，研究人员在逐渐增加化合物浓度的条件下，连续传代培养LUJVRV，以筛选出具有耐药性的病毒突变株。同时设置溶剂（DMSO）对照传代。当耐药性不再增强时停止传代，提取耐药病毒的RNA，逆转录并扩增GPC基因片段进行测序，以鉴定可能引起耐药性的突变位点。随后，通过定点突变技术将鉴定的突变引入到假型病毒（LUJVPV）中，验证该突变是否确实导致对化合物的敏感性下降（即产生耐药性）。

6. 广谱抗病毒活性测试：为了评估命中化合物是否对其他致病性沙粒病毒也具有抑制活性，研究测试了它们对一系列假型病毒（包括拉沙病毒LASV、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒LCMV、莫佩亚病毒MOPV、胡宁病毒JUNV、马秋波病毒MACV、瓜纳里托病毒GTOV、萨比亚病毒SBAV和查帕雷病毒CHAPV）入侵的抑制效果，并计算了相应的IC50值。此外，使用可在BSL-2条件下操作的、真实的LCMV CL-13毒株，在VERO细胞上验证了化合物对活病毒感染的抑制效果，通过实时定量PCR（qPCR）检测病毒RNA拷贝数来评估抑制率。

7. 细胞靶点验证——RNA干扰实验：鉴于马尼地平和乐卡地平是二氢吡啶类电压门控钙通道（VGCC）拮抗剂，且已有报道称VGCC对新世界沙粒病毒入侵至关重要，研究通过RNA干扰（RNAi）技术敲低VGCC的关键亚基基因（CACNA1S和CACNA2D2），来验证钙通道在LUJV入侵中的作用。使用小干扰RNA（siRNA）在U-2 OS细胞中敲低目标基因表达，然后感染LUJVPV、MACVPV和VSVPV，通过荧光素酶报告基因检测（RLuc）和qPCR评估病毒感染水平的变化，并通过蛋白质印迹（WB）验证敲低效率。

三、 主要研究结果

1. 高通量筛选成功鉴定三种LUJV入侵抑制剂：经过三轮筛选，从1775种化合物中成功鉴定出曲美替尼（一种MEK抑制剂，用于治疗黑色素瘤）、马尼地平和乐卡地平（均为二氢吡啶类钙通道拮抗剂，用于治疗高血压）作为高效的LUJV入侵抑制剂。它们在微摩尔浓度下即显示出显著的抑制活性。其中，曲美替尼的抑制效果最强，其IC50为0.3566 µM，选择性指数（SI）大于560，显示出良好的治疗窗口。

2. 作用机制存在差异：

   • 曲美替尼：通过膜融合实验发现，曲美替尼能显著抑制LUJV GPC介导的合胞体形成，且呈剂量依赖性。这表明其作用机制是阻断病毒与宿主细胞的膜融合过程。
   • 马尼地平和乐卡地平：膜融合实验显示，即使在较高浓度下，这两种化合物对LUJV GPC介导的膜融合抑制效果也很弱或几乎没有。提示它们可能通过其他机制抑制病毒入侵。

3. 曲美替尼的病毒靶点为GPC的C410位点：通过对曲美替尼耐药病毒株的筛选和测序，发现在LUJV GPC的GP2亚基跨膜区（TM）第410位氨基酸发生了半胱氨酸（C）到甘氨酸（G）的突变（C410G）。将该突变引入假型病毒后，病毒对曲美替尼产生了显著的耐药性，但对马尼地平和乐卡地平依然敏感。在膜融合实验中，携带C410G突变的GPC在曲美替尼存在下仍能形成合胞体，而野生型则被完全抑制。这直接证明C410是曲美替尼在LUJV上的作用靶点。进一步研究发现，邻近的C412位点突变（C412G）或双突变（C410G/C412G）并不影响病毒对曲美替尼的敏感性（C412G）或与C410G单突变表型一致（双突变），确认了C410是唯一的关键靶点。

   • 值得注意的是，在筛选拉沙病毒（LASV）对曲美替尼的耐药突变时，发现了位于GP2跨膜区的另一个位点F446L。该位点在哺乳动物沙粒病毒中高度保守，且此前已被报道可介导对其他结构不同的膜融合抑制剂的耐药性。将F446L突变引入LASV、MOPV和LCMV的假型病毒中，均能使其对曲美替尼产生耐药性，表明曲美替尼可能通过作用于GPC跨膜区的保守疏水残基来发挥广谱抑制作用。

4. 马尼地平和乐卡地平通过抑制钙通道发挥作用：尽管未能筛选到针对这两种化合物的病毒耐药突变株，但RNA干扰实验提供了关键证据。敲低VGCC的α1亚基（CACNA1S）或α2δ2亚基（CACNA2D2）基因后，LUJVPV和MACVPV（一种新世界沙粒病毒）的感染均受到显著抑制，而VSVPV的感染不受影响。这与已知VGCC对新世界沙粒病毒入侵至关重要的结论一致，并首次证明VGCC对LUJV（一种使用不同受体的沙粒病毒）的入侵同样关键。结合它们对膜融合无直接抑制作用的实验结果，可以得出结论：马尼地平和乐卡地平是通过作为钙通道拮抗剂，干扰宿主细胞的钙离子信号或功能，从而间接抑制LUJV的入侵。

5. 三种化合物均具有广谱抗病毒活性：

   • 曲美替尼：对所有测试的致病性沙粒病毒（包括旧世界和新世界）假型病毒入侵均有抑制效果，IC50在0.756至10.36 µM之间。对真实的LCMV活病毒感染也表现出抑制，IC50为3.919 µM。
   • 马尼地平和乐卡地平：对新世界沙粒病毒假型病毒的入侵抑制效果尤为显著，IC50在~0.1至1 µM之间，剂量-效应曲线呈现典型的“S”型。对旧世界沙粒病毒假型病毒的抑制效果相对模糊，但对真实的LCMV活病毒感染却显示出明确的抑制活性（马尼地平IC50=2.344 µM，乐卡地平IC50=1.093 µM）。此外，在回顾整个FDA药物库时，发现除了这两种化合物外，还有另外12种钙通道阻滞剂在10 µM浓度下对LUJVRV感染抑制率超过90%，进一步支持钙通道是重要的抗病毒靶点。

四、 研究结论与价值

本研究成功从FDA已批准药物库中筛选出三种能够有效抑制LUJV入侵的化合物：曲美替尼、马尼地平和乐卡地平。研究不仅鉴定了候选药物，还深入阐明了其作用机制：曲美替尼通过靶向病毒GPC跨膜区的C410位点（在LASV等病毒中为F446位点）直接抑制膜融合；而马尼地平和乐卡地平则是作为钙通道拮抗剂，通过干扰宿主细胞的电压门控钙通道功能来间接抑制病毒入侵。

本研究的科学价值在于： 1. 提供了潜在的抗病毒候选药物：为目前尚无特效疗法的卢约出血热及其他沙粒病毒感染提供了新的治疗选择。药物再利用策略使得这些候选药物有可能更快地进入临床评估。 2. 揭示了新的病毒弱点与宿主依赖性：首次报道了靶向LUJV GPC SSP-GP2界面的入侵抑制剂及其具体作用位点（C410），进一步印证了该界面是设计沙粒病毒抑制剂的通用平台。同时，首次明确了电压门控钙通道在LUJV入侵中的关键作用，拓展了对沙粒病毒入侵宿主细胞机制的理解。 3. 阐明了化合物的广谱抗病毒潜力：三种化合物，特别是曲美替尼，对多种高致病性沙粒病毒显示抑制活性，提示它们可能用于应对多种沙粒病毒引发的出血热。 4. 强调了钙信号在病毒感染中的重要性：研究结果强化了钙离子在LUJV感染过程中的关键作用，为针对宿主因子开发抗病毒策略提供了新的思路。

五、 研究亮点

1. 创新性的筛选策略与平台：巧妙利用携带LUJV GPC的复制能力型重组病毒（LUJVRV）在BSL-2条件下安全、高效地完成了针对BSL-4病原体的高通量药物筛选。
2. 机制研究的深度与系统性：不仅完成了表型筛选，还综合运用膜融合实验、耐药病毒筛选与反向遗传学、细胞靶点敲低等多种技术手段，清晰地阐明了不同化合物截然不同的作用机制（直接靶向病毒蛋白 vs. 靶向宿主因子）。
3. 重要的新发现：
   • 首次鉴定出C410作为LUJV GPC上曲美替尼的作用位点，并证实曲美替尼通过该位点抑制膜融合。
   • 首次证明电压门控钙通道是LUJV入侵所必需的宿主因子，从而将钙通道拮抗剂的抗病毒谱从新世界沙粒病毒扩展到了使用不同受体（NRP2）的LUJV。
   • 发现曲美替尼对多种沙粒病毒具有广谱抑制活性，并鉴定出在旧世界沙粒病毒中保守的F446是其作用靶点之一。
4. 明确的转化医学潜力：所鉴定的化合物均为已获批药物，其安全性、药代动力学参数已知，大大降低了后续开发的成本和风险，为应对潜在的沙粒病毒疫情提供了即时的备选治疗方案。

六、 其他有价值的内容

研究还提及了第四个初筛命中化合物奥培米芬（一种选择性雌激素受体调节剂，SERM），以及整个SERM药物类别在初筛中均显示出对LUJV的有效抑制（75-99%）。尽管因其细胞毒性或对VSV的抑制而未深入探究，但这一现象提示雌激素信号通路可能参与LUJV感染过程，其核心化学结构可作为未来结构-活性关系优化和药物设计的骨架，具有一定的启发意义。此外，研究建立的膜融合可视化评估方法（结合CD63表面定位和ImageJ图像分析）为定量研究GPC的融合活性提供了实用方案。