关于VEGF-B作为内质网应激新型介导因子通过RGD结合整合素诱导心脏血管生成的研究报告
一、 研究团队与发表信息
本研究由Rahul Mallick、Ahmed B. Montaser、Henna Komi、Greta Juusola、Annakaisa Tirronen、Erika Gurzeler、Maria Barbiera、Petra Korpisalo、Tetsuya Terasaki、Tiina Nieminen和Seppo Ylä-Herttuala共同完成。研究人员主要来自芬兰东芬兰大学（University of Eastern Finland）的健康科学学院A.I. Virtanen分子科学研究所、药学院以及库奥皮奥大学医院心脏中心与基因治疗部。该研究成果于2025年3月6日被接受，发表在《分子治疗》（Molecular Therapy）期刊2025年7月的第33卷第7期上。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于心血管生物学与治疗性血管生成（Therapeutic Angiogenesis）领域。血管内皮生长因子B（Vascular Endothelial Growth Factor B， VEGF-B）是VEGF家族成员之一，已知其全长形式VEGF-B186能促进健康及缺血心肌的血管生长。然而，尽管VEGF-B186是血管内皮生长因子受体1（VEGF Receptor 1， VEGFR1）和神经纤毛蛋白（Neuropilin， NRP）的配体，但其促进血管生成的具体机制和信号通路长期以来并不明确。传统观点认为VEGF家族成员主要通过其酪氨酸激酶受体（如VEGFR1、VEGFR2）发挥作用。本研究旨在深入探索VEGF-B186诱导心脏血管生成的分子机制，特别是明确VEGFR1和NRP在其作用中是否必需，并试图发现可能存在的其他受体和信号通路。
为此，研究团队设定了明确的研究目标：1）在VEGFR1酪氨酸激酶功能缺失的动物模型中，验证VEGF-B186及其不能结合NRP的突变体VEGF-B186R127S是否仍能诱导血管生成；2）利用体外细胞模型和多种在体模型（正常与缺血猪心、野生型小鼠），系统研究VEGF-B的作用机制；3）鉴定VEGF-B的新型受体；4）阐明其下游信号转导通路，特别是与内质网（Endoplasmic Reticulum， ER）应激和未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response， UPR）的关联。
三、 详细研究流程与方法
本研究采用了多层次、多模型的综合性实验策略，流程可概括为以下几个主要部分：
1. 在体基因治疗与表型分析： * 研究对象与处理： 研究使用了三种动物模型：a) VEGFR1酪氨酸激酶敲除（VEGFR1 TK-/-）小鼠（n=15），用于排除VEGFR1下游信号的影响；b) 野生型C57BL/6J小鼠（n=19），作为对照验证；c) 猪模型，包括健康猪（n=18）和通过放置瓶颈支架诱导左前降支缺血2周的猪（心肌梗死模型，n=15）。 * 基因转移： 通过超声引导下闭胸心肌内注射或心内膜下导管注射的方式，将腺病毒载体分别递送至小鼠或猪的心脏。使用的载体包括：表达VEGF-B186的腺病毒（Ad-VEGF-B186）、表达不能结合NRP的突变体VEGF-B186R127S的腺病毒（Ad-VEGF-B186R127S）、以及空载体对照（Ad-CMV或Ad-LacZ）。选择腺病毒是因为其能介导强效但短暂的表达，避免了长期表达可能引起的心脏肥大风险。 * 表型评估： 基因转移6天后，处死动物收集心脏组织和血浆样本。通过免疫组织化学染色（如CD31标记血管内皮细胞）定量分析心肌微血管面积和数量，评估血管生成效果。通过检测血浆中血管生成因子（如VEGF-A、血管生成素-2 Angiopoietin-2， Angpt2）和造血生长因子（如粒细胞集落刺激因子G-CSF、巨噬细胞集落刺激因子M-CSF）的水平，评估系统的激活状态。同时，利用Ki67等增殖标记物与细胞类型特异性标记物（如心肌肌钙蛋白T cTnT、CD31、PDGFR-β、c-Kit）共染色，鉴定心脏内增殖细胞的类型。
2. 体外细胞机制研究： * 细胞模型： 使用了人心脏微血管内皮细胞（Human Cardiac Microvascular Endothelial Cells， HMVEC-Cs）、人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells， HUVECs）和永生化人主动脉内皮细胞（TeloHAECs）。 * 基因操作与处理： 在细胞中进行腺病毒转导（Ad-VEGF-B186, Ad-VEGF-B186R127S, Ad-VEGF-A165, Ad-CMV）或直接使用重组蛋白处理。为了探究特定基因的功能，使用了小干扰RNA（siRNA）技术敲低（knockdown）目标基因，包括FLT1（编码VEGFR1）、XBP1、ITGAV（编码整合素αV）、ITGA5（编码整合素α5）。 * 分子与功能检测： 通过RNA测序（RNA-seq）和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis， GSEA）全面分析基因表达变化。通过实时定量PCR（qRT-PCR）验证特定基因的mRNA表达水平。通过蛋白质印迹（Western Blot）检测相关蛋白（如Bip/GRP78、ATF6、G-CSF、整合素等）的表达。通过酶联免疫吸附测定（Luminex）等技术检测细胞上清或血浆中的细胞因子。
3. 新型受体鉴定： * 交联/质谱分析： 为了寻找VEGF-B186的新型相互作用蛋白，研究采用了化学交联结合质谱分析的方法。使用磺基-SBED（Sulfo-SBED）生物素标记转移试剂处理VEGF-B186蛋白，然后将其与内皮细胞孵育，通过紫外线激活交联。随后裂解细胞，通过链霉亲和素下拉交联复合物，再进行质谱鉴定。这是一种揭示蛋白质-蛋白质相互作用的有效手段。 * 免疫共沉淀验证： 使用镍柱下拉His标签的VEGF-B186，或用Protein A/G磁珠下拉VEGF-B186-Fc融合蛋白，从细胞裂解液中富集与VEGF-B186结合的蛋白复合物，然后通过蛋白质印迹验证特定蛋白（如整合素）的存在。
4. 数据分析： * RNA-seq数据使用Trimmomatic进行修剪，STAR比对到人类参考基因组，通过DESeq2进行差异表达基因分析。GSEA用于分析生物学通路的富集情况。 * 组织学和细胞计数数据使用Fiji ImageJ2软件进行盲法分析。 * 统计差异通过t检验、单因素或双因素方差分析（ANOVA）及相应的多重比较检验进行评估，显著性水平设为p < 0.05。
四、 主要研究结果
1. VEGFR1和NRP对于VEGF-B诱导的心脏微血管生长并非必需： 在VEGFR1 TK-/-小鼠心脏中，无论是Ad-VEGF-B186还是Ad-VEGF-B186R127S，在基因转移6天后均能显著增加CD31阳性的微血管面积和数量，效果与对照病毒相比提升约1.3倍。由于VEGF-B186R127S不能结合NRP，且小鼠缺乏VEGFR1下游信号，这一结果首次明确证明，VEGF-B186诱导的血管生成可以不依赖于VEGFR1和NRP的信号通路。
2. VEGF-B促进非心肌细胞的增殖，并激活内皮细胞： 在VEGFR1 TK-/-小鼠心脏中，VEGF-B处理增加了Ki67阳性的增殖细胞数量。重要的是，这些增殖细胞并非心肌细胞（不表达cTnT），而是位于血管周围，包括CD31+的内皮细胞和PDGFR-β+ c-Kit+的间充质基质细胞。这表明VEGF-B能动员和增殖血管周围的辅助细胞。同时，VEGF-B处理显著上调了血浆中促血管生成因子（VEGF-A， Angpt2）和造血生长因子（G-CSF， M-CSF）的水平。在敲低FLT1的HMVEC-Cs中也观察到了VEGF-A和Angpt2的上调，进一步证实了这种内皮激活不依赖于VEGFR1。
3. VEGF-B通过诱导内质网应激发挥作用： RNA-seq和GSEA分析显示，在HMVEC-Cs中，Ad-VEGF-B186和Ad-VEGF-B186R127S最显著上调的基因集与内质网应激相关。与VEGF-A165相比，VEGF-B诱导的ER应激相关基因表达更广泛、变化倍数更高。在动物模型（VEGFR1 TK-/-小鼠、野生型小鼠、正常及缺血猪心）的心脏组织中，免疫染色证实VEGF-B基因治疗特异性地在内皮细胞（而非心肌细胞）中诱导了内质网应激标志蛋白Bip的表达。这些活化的、处于ER应激状态的内皮细胞同时高表达G-CSF和GM-CSF等造血生长因子。在HUVECs中，VEGF-B186蛋白或腺病毒转导能上调Bip、ATF6和G-CSF，而VEGF-A165则不能，突出了VEGF-B作用的独特性。
4. RGD结合整合素是VEGF-B的新型受体，介导ER应激和血管生成： 通过交联/质谱分析和免疫共沉淀实验，研究团队首次鉴定出整合素αV（ITGAV/CD51）和整合素α5（ITGA5/CD49e）是VEGF-B186的新型结合受体。这些整合素属于RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列结合整合素家族。敲低FLT1不影响VEGF-B与这些整合素的结合。功能上，在TeloHAECs中敲低ITGAV（而非ITGA5）显著抑制了VEGF-B186诱导的ER应激相关基因（ATF6， ERN1， EIF2AK3）、促血管生成基因（VEGFA， ANGPT2）以及造血生长因子基因（CSF1， CSF2， CSF3）的表达。这表明，整合素αV是介导VEGF-B下游效应的关键受体。
5. XBP1是连接ER应激与血管生成的关键转录因子： XBP1是UPR通路中的一个关键转录因子。在HUVECs中敲低XBP1，不仅降低了ER应激伴侣蛋白Bip的表达，还显著抑制了VEGF-B186诱导的促血管生成因子（ANGPT2， VEGFA）和造血生长因子（CSF1， CSF2， CSF3）的基因表达。这证明VEGF-B通过整合素诱导的ER应激，经由XBP1激活了下游的促血管生成和造血细胞因子程序，从而将ER应激与功能性血管生成联系起来。
五、 研究结论与意义
本研究得出了几个突破性的结论： 1. 机制革新： VEGF-B186诱导心脏血管生成的主要机制不依赖于其经典受体VEGFR1和NRP，而是通过新发现的受体——RGD结合整合素（主要是整合素αV）来实现。 2. 信号通路创新： VEGF-B186通过整合素激活内皮细胞的内质网应激反应和未折叠蛋白反应（UPR），特别是上调XBP1，进而驱动一系列促血管生成因子和造血生长因子的表达，最终促进血管生长和周围支持细胞的增殖。 3. 治疗潜力： 不能结合NRP的突变体VEGF-B186R127S具有与野生型VEGF-B186相似的促血管生成能力，且避免了其C端片段可能带来的致心律失常风险，因此VEGF-B186R127S被提出作为一个有前景的治疗性血管生成候选药物，用于治疗冠状动脉疾病等心肌缺血性疾病。
该研究的科学价值在于彻底改变了人们对VEGF-B作用机制的理解，将其从经典的VEGFR信号通路框架中解放出来，并建立了一个全新的“整合素-ER应激-XBP1-细胞因子”信号轴。这为理解生长因子信号转导的复杂性提供了新范式。其应用价值在于为开发治疗心肌缺血的新一代基因疗法或蛋白质疗法指明了新的靶点和更安全的药物形式（VEGF-B186R127S）。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究也客观指出了VEGF-B治疗的潜在风险和局限性。长期、过度的VEGF-B表达可能因持续ER应激导致心脏功能障碍、扩张型心肌病甚至心脏肥大。这提示未来临床应用需采用可控的、短期的表达策略（如本研究使用的腺病毒载体）。此外，研究在讨论部分提出，VEGF-B诱导的造血生长因子（如G-CSF， GM-CSF）可能通过招募内皮祖细胞和减轻炎症来促进血管修复，这为理解其治疗效应提供了更广阔的免疫-血管生成相互作用视角。最后，研究数据提示细胞可能通过上调MANF（中脑星形胶质细胞源性神经营养因子）等因子来缓解VEGF-B诱导的ER应激，揭示了细胞内在的反馈调节机制。