一项名为CRMA-1001的在研表观遗传沉默疗法的临床前研究发表于 *Nature Biomedical Engineering*。该研究由nChroma Bio（美国波士顿）的Jennifer L. Marlowe、Yesseinia Anglero-Rodriguez、Qiang Xiong等，联合意大利圣拉斐尔科学研究所的Angelo Lombardo、Martino Alfredo Cappelluti及米兰大学等机构的研究人员共同完成。研究展示了一种通过靶向DNA甲基化持久沉默乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）转录的候选药物，在动物模型中实现了功能性治愈标准的病毒学应答。

研究背景

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）影响全球约2.5亿人，每年导致超过100万人死于肝硬化和肝细胞癌。现有的一线疗法——核苷（酸）类似物（nucleos(t)ide analogues，NUCs）虽能有效抑制HBV DNA复制，却很少实现乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）血清清除，患者难以达到功能性治愈。HBV持续存在的根源在于肝细胞核内的共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）及整合入宿主基因组的HBV DNA（integrated HBV DNA，intDNA）。表观遗传修饰，尤其是CpG岛（CpG islands，CGIs）的DNA甲基化，在调控HBV基因表达中发挥关键作用。基于此，研究者开发了CRMA-1001——一种由脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）共递送向导RNA（guide RNA，gRNA）和编码表观遗传效应蛋白（epigenetic effector，EE）的mRNA的治疗药物。EE融合蛋白包含催化失活的SpCas9（dSpCas9）、KRAB转录抑制结构域及DNMT3A–DNMT3L甲基化效应结构域，可在gRNA引导下靶向HBV DNA特定区域并沉积甲基化标记，从而在不切割DNA的情况下持久沉默病毒转录。

研究流程与主要结果

研究首先进行了gRNA筛选与效应蛋白优化。研究者设计了121条覆盖HBV全基因组开放阅读框（open reading frames，ORFs）的gRNA，在HBV基因型D感染的HepG2-NTCP细胞中筛选，51条gRNA对HBsAg或HBeAg的沉默效率超过50%。基于抗病毒活性、靶点位置及跨基因型保守性，选出4条先导gRNA（HBV-gRNA1–4）。在稳定表达整合型HBV的HepG2.2.15细胞中，HBV-gRNA2表现出最强且最持久的剂量依赖性抗原抑制，且其结合位点在基因型A–H中保守性达94%。亚硫酸盐测序显示HBV-gRNA2诱导的从头甲基化（de novo methylation）水平最高，与HBsAg沉默效率相关。在AAV-HBV小鼠模型中，HBV-gRNA2同样显示最大HBsAg降低。随后，利用非人灵长类动物（non-human primates，NHPs）中内源性替代靶点PCSK9，研究者优化了EE蛋白的甲基化效应结构域氨基酸序列，比较了EE4000、EE6000和EE7000三种构建体。在转基因hPCSK9小鼠和NHPs中，EE7000的效力分别比EE4000提高约4倍和2倍。在NHPs中，单次1.5 mg/kg的PCSK9靶向EE7000即实现饱和性PCSK9降低，且持续至少2年。由此确定EE7000与HBV-gRNA2组合为最终候选药物CRMA-1001。

接着，研究评估了CRMA-1001对整合型HBV DNA的沉默效果。在含1.28倍HBV基因型A整合拷贝的转基因HBV小鼠（tg-HBV）中，单次静脉注射HBV-EE4000（含EE4000的早期构建体）产生剂量依赖性的血浆HBsAg和HBV DNA降低，最大降幅分别达2.7 log10和2.9 log10，并维持7个月。在≥0.5 mg/kg剂量组中，15只小鼠中的11只达到HBsAg不可检测水平，同时出现可测量的乙型肝炎表面抗体（anti-HBs）。肝脏免疫组织化学显示最高剂量组98%的肝细胞HBeAg阴性。甲基化测序证实整合HBV基因组发生剂量依赖性CpG甲基化。CRMA-1001（含EE7000）在2.0 mg/kg剂量下较HBV-EE4000在3.0 mg/kg剂量下HBsAg降幅额外增加约1.3 log10，证实EE优化的转化效果。在HepG2.2.15细胞中，CRMA-1001处理后24小时gRNA、效应mRNA和效应蛋白达峰，7天内全部清除；HBV intDNA甲基化和HBsAg沉默于第3天达峰并持续至第14天实验结束。在PLC/PRF/5细胞（天然整合HBV基因型A片段的患者来源肝癌细胞系）中同样观察到HBsAg沉默。

针对cccDNA的研究在HBV感染的HepG2-hNTCP细胞和原代人肝细胞（primary human hepatocytes，PHHs）中进行。CRMA-1001处理后7天（HepG2-hNTCP）和14天（PHHs），HBsAg和HBeAg均降低98%。从PHHs中富集的cccDNA甲基化分析显示，处理组CpG甲基化率为0.29%–66.42%，最高水平位于CGI II，而对照组为0.01%–0.39%。在AAV-HBV小鼠模型中（载有更高HBV DNA负荷，约每二倍体基因组4.5拷贝），单次CRMA-1001产生剂量依赖性持久降低：最大平均降幅为HBsAg 3.4 log10、HBV DNA 2.3 log10、HBeAg 1.7 log10，持续6个月。每月一次共3次给药（q4w×3）在相同剂量下较单次给药进一步降低HBsAg约1.6 log10。6个月时，q4w×3给药组中0.5和1.0 mg/kg剂量分别有60%和90%的动物HBsAg低于定量下限（lower limit of quantification，LLOQ），HBV DNA则分别为70%和90%。单次给药组中31%（22/70）的动物实现HBsAg和HBV DNA双低于LLOQ。在联合恩替卡韦（entecavir，ETV）实验中，ETV单独仅降低HBV DNA而对HBsAg和HBeAg无影响；联合治疗显示出对HBV DNA的叠加抑制效应。

在NHPs中的药代动力学（pharmacokinetics，PK）与生物分布研究显示，单次静脉输注2 mg/kg CRMA-1001后，离子化脂质、gRNA和效应mRNA的血浆峰浓度（Cmax）分别在输注结束时达到4.29×10⁵ µg/ml、495 ng/ml和3,090 ng/ml，24小时后进入终末清除相，第28天低于Cmax的0.01%。组织分布以肝脏和脾脏最高，第28天肝脏和脾脏mRNA水平低于1小时肝脏浓度的0.1%。原位杂交显示效应mRNA在肝窦内皮细胞染色最强，肝细胞水平较低；生殖细胞（睾丸生殖上皮、卵母细胞）未检测到染色。在q4w×3、最高2 mg/kg的GLP毒理研究中，CRMA-1001相关效应仅限于最高剂量组的血清化学指标：每次给药后肝酶（ALT、AST）短暂升高，末次给药后4周恢复，无临床观察或组织病理学关联，判定为非不良反应。

特异性评价

研究者开展了全基因组特异性评估。发现阶段采用RNA测序（RNA-seq）、人类甲基化组杂交捕获测序（HCMS）和全基因组甲基化测序（WGMS），以及gRNA结合位点的计算机预测（in silico）分析，在三种原代人类细胞（PHHs、脾内皮细胞、肾上腺皮质细胞，共9名供体）中筛选潜在脱靶。共提名1,591个基因组区域。确认阶段采用定制HCMS，在PHHs中确认4个高甲基化差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMRs），邻近6个基因。这6个基因与RNA-seq发现的352个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）之间无重叠，因此未检测到任何经验证的意外靶标（verified unintended targets，VUTs）。

结论与价值

该研究表明CRMA-1001通过靶向表观遗传沉默机制，能够在不切割DNA的情况下持久抑制HBV转录，单次给药即在小鼠模型中实现超过3 log10的病毒标志物降低，三次给药使高达90%的动物达到HBsAg和HBV DNA不可检测水平，符合功能性治愈的临床前标准。CRMA-1001的效应蛋白mRNA和gRNA在体内快速清除，而甲基化修饰持久存在。在NHPs中，单次给药对PCSK9的沉默持续至少2年，提示其药效的长久性。安全性方面，仅在最高剂量组观察到短暂可逆的转氨酶升高。全基因组特异性评估未发现经验证的意外靶标，且无生殖细胞分布，支持其临床开发的安全性基础。

研究亮点

该研究的关键价值在于：其一，CRMA-1001代表了一种不同于基因编辑和RNA干扰的新型治疗模式——表观遗传沉默，通过诱导宿主固有的DNA甲基化机制实现对病毒转录模板的持久功能性灭活；其二，研究系统性地优化了gRNA和效应蛋白，利用PCSK9替代靶点实现了跨物种药效转化；其三，在多个互补的HBV模型中（整合型、附加体型、自然感染细胞模型）验证了药理学活性，并结合NUCs显示了叠加抗病毒效果；其四，全基因组特异性评估采用了多组学正交方法，为表观遗传药物的脱靶风险评估提供了范式。

其他有价值的内容

研究团队还指出，现有HBV体内模型均不能完全重现人类感染病理，但研究所选模型（AAV-HBV和tg-HBV）在评估药理学活性和持久性方面具有互补价值。此外，研究中关于甲基化水平与沉默效率之间的“部分平均甲基化即可导致近似完全沉默”的机制解释，为表观遗传药物的药效学评价提供了重要视角。CRMA-1001所采用的EE7000已在NHPs中实现PCSK9的饱和性抑制并持续2年以上，这一数据进一步支持了该平台在其他肝脏靶点上的广泛应用潜力。该研究为CRMA-1001进入临床开发提供了充分的药理学、特异性及安全性依据。