类型a：学术研究报告

作者及机构
本研究由Benjamin M. Akiyama、Hannah M. Laurence、Aaron R. Massey等共同完成，主要作者来自美国科罗拉多大学丹佛分校医学院（University of Colorado Denver School of Medicine）、德克萨斯大学医学分部（University of Texas Medical Branch）等机构。研究于2016年11月10日在线发表于《Science》期刊，标题为“Zika virus produces noncoding RNAs using a multi-pseudoknot structure that confounds a cellular exonuclease”。

学术背景
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种蚊媒黄病毒（flavivirus），与登革热病毒（Dengue virus, DENV）、西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）等同属。近年来，ZIKV的爆发与胎儿小头症（microcephaly）和格林-巴利综合征（Guillain-Barré syndrome）密切相关，因此亟需解析其分子致病机制。

此前研究发现，相关黄病毒可通过其3′非翻译区（3′ untranslated region, 3′UTR）产生非编码亚基因组RNA（subgenomic flaviviral RNAs, sfRNAs），这些RNA能够抵抗宿主5′→3′核酸外切酶XRN1的降解，进而干扰宿主抗病毒反应，促进病毒致病性。然而，ZIKV是否产生sfRNAs及其结构基础尚不清楚。本研究旨在揭示ZIKV sfRNAs的形成机制及其结构特征，为抗病毒治疗提供新靶点。

研究流程
1. sfRNAs的检测与验证
- 研究对象：ZIKV毒株PRVABC59感染的人源（A549）、猴源（Vero）、蚊源（C6/36）细胞及小鼠原代神经元。
- 实验方法：通过Northern blot分析感染细胞的总RNA，使用针对ZIKV 3′UTR的探针检测sfRNAs。
- 结果：所有感染细胞均检测到大小不同的sfRNAs，其中最大的sfRNA（sfRNA1）在所有细胞中均存在，而其他sfRNAs的分布具有细胞类型依赖性。

1. XRN1抗性结构（xrRNA）的鉴定

   • 生物信息学预测：基于已知黄病毒xrRNA的序列和结构特征，在ZIKV 3′UTR中预测了两个潜在的xrRNA（xrRNA1和xrRNA2）。
     
   • 体外验证：将ZIKV 3′UTR全长或缺失xrRNA1的片段与XRN1共孵育，通过凝胶电泳分析抗性RNA片段。结果显示，xrRNA1能完全阻断XRN1的降解，而xrRNA2仅在xrRNA1缺失时表现出部分抗性。
     

2. xrRNA1的晶体结构解析

   • 样品制备：选择ZIKV MR766-NIID毒株的xrRNA1序列，通过突变优化以提高RNA转录和结晶效率。
     
   • X射线晶体学：解析了xrRNA1的71个核苷酸的高分辨率结构（PDB: 5TPY），发现其形成复杂的多伪结（multi-pseudoknot）折叠。
     
   • 结构特征：
     
     • 5′端通过碱基三联体（U4•A24-U42）和长程碱基对（G3-C44）固定。
       
     • 伪结（L3-S4）由4个连续的G-C碱基对稳定，完全包裹5′端，形成“套索”结构。
       
     • 新发现的A37-U51非经典碱基对定义了环的大小（14核苷酸），在多种黄病毒中高度保守。
       

3. 功能验证与突变分析

   • 伪结破坏实验：通过突变（如pkmut1和pkmut2）破坏伪结后，xrRNA1的XRN1抗性显著降低；回复突变（comp）可恢复抗性。
     
   • 病毒感染实验：利用ZIKV感染性克隆构建xrRNA1突变病毒，Northern blot显示突变体sfRNAs产量显著减少，证实xrRNA1是sfRNA形成的关键。
     

4. XRN1与xrRNA相互作用的模型

   • 基于结构数据，提出xrRNA1通过多伪结和P4茎环（stem-loop）与XRN1表面带正电区域结合，阻断其加工活性。
     

主要结果
1. sfRNAs的普遍性：ZIKV在所有测试细胞中均产生sfRNAs，但模式因细胞类型而异，提示宿主因子可能调控xrRNA功能。
2. xrRNA1的核心作用：xrRNA1在体外和感染实验中均表现出强XRN1抗性，是sfRNA生成的主要位点。
3. 结构创新性：xrRNA1的多伪结结构是迄今解析最完整的黄病毒xrRNA，揭示了保守的“套索”机制。
4. 突变表型：破坏伪结或关键碱基对可显著降低sfRNA产量，为减毒疫苗设计提供依据。

结论与意义
1. 科学价值：首次阐明ZIKV sfRNAs的结构基础，扩展了对黄病毒非编码RNA功能的理解。
2. 应用潜力：xrRNA1的结构特征可作为抗病毒靶点，例如通过小分子干扰伪结形成或设计减毒疫苗。
3. 跨病毒保守性：xrRNA1的保守性提示其他黄病毒可能采用类似机制，为广谱抗病毒策略提供思路。

研究亮点
1. 结构生物学突破：首次解析ZIKV xrRNA1的完整折叠，揭示多伪结的“套索”机制。
2. 方法学创新：结合体外生化、细胞感染和结构生物学，系统性验证xrRNA功能。
3. 转化医学意义：为靶向sfRNA的抗病毒药物或疫苗开发奠定基础。

其他价值
研究发现XRN1敲低仅部分抑制sfRNAs生成，提示可能存在其他核酸酶的冗余作用，未来需进一步探索宿主-病毒互作网络。