关于快速生长且鲁棒的酿酒酵母底盘菌株XP的全面表征与应用研究

作者与发表信息 本研究由上海交通大学微生物代谢国家重点实验室、生命科学与技术学院的杨丹宇龙（Yangdanyu Long）、韩晓（Xiao Han）、孟轩霖（Xuanlin Meng）、许平（Ping Xu）和陶飞（Fei Tao）共同完成。研究成果以研究论文（Research Article）的形式，于2024年2月发表于微生物学领域的学术期刊《mBio》（卷15，期2）。文章标题为“A Robust Yeast Chassis: Comprehensive Characterization of a Fast-Growing Saccharomyces cerevisiae”。

学术背景 本研究属于合成生物学与代谢工程领域。酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）因其公认安全（GRAS）状态、与工业发酵的兼容性以及对终产物的高耐受性，被广泛用作合成生物学的底盘生物。然而，与大肠杆菌（*E. coli*）等原核生物相比，酿酒酵母的生长速率通常较慢，这限制了其在高效生物制造中的应用潜力。此外，工业菌株的遗传操作（尤其是二倍体菌株）往往存在挑战。因此，发掘和开发生长更快、鲁棒性更强且易于遗传操作的酿酒酵母底盘菌株，对于推动其在生物技术中的应用至关重要。

本研究旨在全面表征一株从土壤中分离的、生长快速的酿酒酵母新菌株XP，阐明其快速生长的潜在机制，并为其开发一套高效的遗传操作工具箱。最终，通过构建高效的L-乳酸生产菌株，验证该底盘菌株在工业生物制造中的应用潜力。研究的核心目标是为合成生物学提供一个性能优越的下一代真核微生物底盘。

详细工作流程 本研究是一项综合性研究，涵盖了从菌株表型表征、多组学分析、遗传工具箱构建到工程应用验证的完整流程。

1. 菌株表型表征与生长优势评估：

   • 研究对象： 本研究核心菌株为酿酒酵母XP，同时选取了研究用模式菌株S288C和BY4741，以及工业乙醇生产菌株Ethanol Red作为对照。
   • 实验方法： 使用自动化微生物生长曲线分析系统（Bioscreen C），在四种不同培养基（营养丰富的YPD2、YPD30以及无机盐基础的FM、FM30）中系统比较了各菌株的生长曲线。通过摇瓶发酵模拟工业条件，进一步验证了XP菌株在高糖（30%葡萄糖）环境下的生长和糖耗性能。
   • 数据分析： 通过对数生长期的倍增时间来量化生长差异。使用R包对OD600 < 1.0的数据进行拟合，以确保可靠性。

2. 基因组测序与比较分析：

   • 研究对象： 菌株XP的基因组DNA。
   • 实验方法： 使用PacBio平台对XP菌株进行第三代基因组测序，获得完整基因组序列。使用Augustus软件预测开放阅读框（ORFs）。
   • 数据分析： 将XP的基因组与标准菌株S288C进行比对（使用Mauve软件），分析染色体和线粒体基因组的差异，包括单核苷酸多态性（SNPs）和结构变异。

3. 多组学（代谢组与转录组）分析：

   • 研究对象： 菌株XP和S288C在FM（2%葡萄糖）和FM30（30%葡萄糖）培养基中对数生长期的细胞。
   • 样本量： 代谢组学分析每组6个生物学重复；转录组学分析每组3个生物学重复。
   • 实验方法：
     • 代谢组学： 采用快速过滤和液氮淬灭的方法提取细胞内代谢物。使用Thermo UPLC Q-Extractive（QE）轨道阱质谱系统结合电喷雾离子源（ESI）进行非靶向代谢组学数据采集。使用C18色谱柱，分别在正、负离子模式下进行分析。利用METDNA数据库和MetID算法进行代谢物鉴定和扩增。
     • 转录组学： 使用TRIzol法提取总RNA，构建文库后，在Illumina Hiseq X Ten/Novaseq 6000平台上进行高通量测序（PE150）。
   • 数据分析： 转录组数据经过质控、比对（使用HISAT2）、组装（使用StringTie）和基因表达量化（使用RSEM，TPM方法）。使用DESeq2/DEGseq/EdgeR进行差异表达基因（DEGs）分析。使用GOATools和KOBAS进行GO功能富集和KEGG通路分析。利用OmicsBean平台对转录组和代谢组数据进行联合分析，构建代谢网络全局知识图谱。

4. 遗传操作工具箱的构建：

   • 方法开发： 为XP菌株量身定制了一套遗传操作体系。
     • URA3营养缺陷型构建： 利用Cre/loxP系统，通过两轮同源重组和筛选，成功敲除了二倍体XP菌株的两个URA3等位基因（编码乳清酸-5‘-磷酸脱羧酶），构建了尿嘧啶营养缺陷型菌株XP-3。该菌株可用于基于URA3的筛选。
     • CRISPR/Cas9基因组编辑系统建立： 成功在XP菌株中应用了单质粒和双质粒CRISPR/Cas9系统。通过非同源末端连接（NHEJ）介导的基因失活（如PDC1基因）和同源重组（HR）介导的基因片段删除（如GPD2基因），验证了该系统的有效性。
     • 单倍体构建与倍性转换： 通过玻璃珠破碎法破坏产孢后的母细胞，分离孢子，成功获得了XP及其URA3缺陷型（XP-3）的单倍体菌株（XP-h, XP-h3）。通过PCR验证交配型（MATA），并通过流式细胞术验证DNA含量。此外，通过引入功能性的HO基因（编码同宗接合转换内切酶），实现了单倍体之间的接合，成功将单倍体恢复为二倍体（XP-h-d）。

5. 基于底盘XP的L-乳酸高效生产菌株构建与发酵验证：

   • L-乳酸脱氢酶（L-LDH）筛选： 将来自不同来源（Bacillus coagulans, Bos taurus, *Lactobacillus helveticus*等）的L-LDH基因在XP中表达，通过摇瓶发酵48小时测定L-乳酸产量，筛选出产酸最高的B. coagulans H-1来源的L-LDH。
   • 代谢工程改造： 以表达最佳L-LDH的菌株XH301为起点，通过CRISPR/Cas9系统对乙醇合成模块（编辑PDC1, PDC5, ADH1等基因）、乳酸利用模块（敲除CYB2）和甘油合成模块（敲除GPD2）进行系统改造，构建了一系列工程菌株，旨在将碳通量导向L-乳酸合成。
   • 倍性工程： 对筛选出的高产L-乳酸单倍体菌株XH352进行倍性转换，获得了其二倍体（XH352-d）、三倍体（XH352-tr）和四倍体（XH352-te）菌株，并评估了倍性对生长和产物合成的影响。
   • 发酵性能评估：
     • 摇瓶发酵： 在含有2% CaCO₃的FM10基础培养基中进行厌氧发酵，评估各工程菌株的L-乳酸产量。
     • 5L发酵罐补料分批发酵： 在pH 5的条件下，对最优菌株（XH352及其二倍体XH352-d）进行放大培养，评估其工业应用潜力和稳定性。
     • 低pH耐受性测试： 在5L发酵罐中，测试了二倍体工程菌XH352-d在不同低pH（pH 4和pH 3）条件下的L-乳酸生产性能，以验证底盘XP及其衍生菌株的鲁棒性。

主要结果 1. 生长表型优势： XP菌株在所有测试培养基（YPD2, YPD30, FM, FM30）中均表现出最快的生长速率。例如，在YPD2培养基中，其倍增时间仅为43.61分钟，约为S288C（84.95分钟）的一半，甚至比工业菌株Ethanol Red（53.67分钟）快约10分钟。在高糖（30%）的FM30培养基中，XP的倍增时间（84.04分钟）也显著短于其他菌株。摇瓶发酵显示，XP能稳定消耗葡萄糖，生物量积累更快，证明了其快速稳定的生长优势。 2. 基因组特征： XP的核基因组与S288C在染色体水平上差异不大，但线粒体DNA（mtDNA）长度（115，450 bp）比S288C长34.6%，且存在多处结构变异。特别值得注意的是，XP线粒体基因组中注释了三个*COX2*基因（编码细胞色素c氧化酶复合物IV的Cu²⁺位点），而S288C只有一个。这暗示了XP可能具有更高效的电子传递链。 3. 多组学揭示的快速生长与鲁棒性机制： * 代谢组学： 在高糖条件下，XP与S288C相比，存在大量差异代谢物，富集在甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、D-谷氨酰胺/D-谷氨酸代谢等通路。特别地，精胺（spermidine）在XP中积累更多，这有助于细胞膜和细胞壁的稳定。 * 转录组学： 在高糖条件下，XP相较于S288C有953个差异表达基因（DEGs）。硫代谢（MET5, MET10, MET16, *MET22*显著上调）和硫胺素（维生素B1）代谢（THI5, *THI20*等基因显著上调）通路整体转录水平上调。硫代谢与ATP水平和能量利用正相关，而硫胺素焦磷酸（TPP）是碳代谢中关键酶的辅因子，对细胞生长至关重要。这些结果表明XP具有更强的能量利用和关键生长因子合成能力。同时，与压力感知相关的基因（如FHP, *TSL1*）下调，表明XP对胁迫不敏感。 * 联合分析： 多组学整合分析表明，XP的磷酸戊糖途径（PPP） 的非氧化阶段上调，而氧化阶段下调，可能促使碳通量更多流向糖酵解用于产能。同时，芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）合成通路增强。这些发现为理解XP的快速生长（强能量代谢与充足关键代谢物）和鲁棒性（压力适应性与不敏感性）提供了分子层面的解释。 4. 遗传工具箱成功构建： 成功创建了适用于XP菌株的完整遗传操作体系：URA3营养缺陷型菌株（XP-3）、高效的Cre/loxP和CRISPR/Cas9基因编辑工具、以及单倍体（XP-h）和可逆的倍性转换系统。这为后续对该底盘进行高效的代谢工程改造奠定了基础。 5. L-乳酸高效生产菌株的构建与验证： * 酶筛选与初步改造： 来自B. coagulans H-1的L-LDH在XP中表达效果最佳，摇瓶产量达25.0 g/L。通过对乙醇、甘油合成及乳酸利用途径的逐步编辑，最优单倍体工程菌XH352的L-乳酸产量提升至32.3 g/L（48小时）。 * 倍性影响： 在摇瓶条件下，单倍体XH352的生长和产酸优于其二倍体XH352-d。然而，在5L发酵罐的补料分批发酵中，二倍体XH352-d展现了更好的性能，在pH 5、60小时条件下，L-乳酸滴度、得率和生产率分别达到52.6 g/L、0.22 g/g葡萄糖和0.87 g L⁻¹ h⁻¹，均优于单倍体XH352。三倍体和四倍体性能未进一步提升。 * 低pH耐受性： XH352-d在低pH环境下仍能生产L-乳酸，在pH 4和pH 3条件下分别产酸32.8 g/L和19.6 g/L（60小时），证明了底盘XP赋予工程菌的鲁棒性，有利于降低发酵过程中中和剂的使用成本。

结论与意义 本研究成功全面表征并开发了一株具有快速生长和高鲁棒性的新型酿酒酵母底盘菌株XP。主要结论如下： 1. 底盘性能卓越： XP菌株在多种条件下生长速度显著快于常用实验室和工业菌株，并耐受高糖和低pH环境，具备作为优秀工业底盘的先天优势。 2. 机制阐释： 通过多组学分析，揭示了XP快速生长和鲁棒性的潜在机制，主要归因于其增强的能量代谢（如硫代谢、线粒体功能）、充足的关键生长因子（如硫胺素）合成、以及独特的压力响应模式（如精胺积累、压力感知下调）。线粒体基因组的结构特征（如多个*COX2*拷贝）也可能贡献于其高效生长。 3. 工具箱完备： 为XP建立了包含营养缺陷型筛选、高效基因编辑（Cre/loxP, CRISPR/Cas9）和倍性操作在内的完整遗传操作工具箱，使其易于进行代谢工程改造。 4. 应用验证成功： 利用该底盘及其工具箱，成功构建了高效的L-乳酸生产菌株，并在发酵罐规模验证了其生产性能，特别是在二倍体状态下和低pH环境中的优势，展示了XP在工业生物制造（如可降解塑料前体生产）中的实际应用潜力。

本研究的科学价值在于首次对一株快速生长的野生型酿酒酵母进行了从基因组、表型到分子机制的全面解析，为理解酵母生长速率和鲁棒性的复杂调控网络提供了新的见解。其应用价值在于提供了一个生长更快、更鲁棒、且遗传操作友好的下一代真核微生物底盘，有望缩短发酵周期、提高生产效率、降低生产成本，从而拓宽酿酒酵母在合成生物学和工业生物技术中的应用范围，特别是在生产芳香族化合物和有机酸等领域前景广阔。

研究亮点 1. 研究对象新颖： 聚焦于一株具有显著生长优势的野生型酿酒酵母新菌株XP，而非对现有模式菌株进行改造，发掘了新的生物资源。 2. 研究体系完整： 采用了“表型表征-多组学机制解析-遗传工具箱开发-工程应用验证”的完整研究范式，逻辑严谨，论证充分。 3. 机制深入： 通过整合基因组、转录组和代谢组数据，不仅描述了表型，还深入揭示了其背后可能涉及的硫代谢、硫胺素代谢、磷酸戊糖途径重编程等多层次分子机制，将线粒体基因组特征与表型进行了关联。 4. 技术实用性强： 开发的遗传操作工具箱（特别是CRISPR/Cas9系统的成功应用）和倍性转换方法，为XP及其衍生菌株的后续研究和工程化提供了强大且便捷的技术支持。 5. 应用导向明确： 研究以构建高效L-乳酸生产菌株作为概念验证，不仅展示了XP作为生产底盘的潜力，还发现了工程菌二倍体在发酵罐规模下的性能优势，为工业应用提供了直接参考。对低pH耐受性的测试进一步凸显了其鲁棒性的工业价值。

其他有价值内容 研究还基于多组学分析结果，对底盘XP的潜在适用产品方向进行了推论：由于其增强的磷酸戊糖途径和芳香族氨基酸合成通路，以及强大的电子传递链和NADH供应，XP可能特别适合用于合成芳香族化合物（如萜类、黄酮类）；同时，其对低pH的耐受性也使其成为有机酸生产的理想底盘。这为未来基于XP底盘开发更多高价值产品提供了理论指导。