这篇研究论文由Roma nutti Carina、Keller Leticia、La Torre José、Panzera Yanina、Fuques Eddie、Pérez Ruben和Gallo Calderon Marina共同完成，作者来自阿根廷的Centro de Virología Animal (CEVAN-CONICET)、Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein (CONICET)以及乌拉圭的Universidad de la República。研究发表于2020年的《Journal of Virological Methods》，题目为《Virus isolation and full-length genome sequencing of a representative canine distemper virus wild type strain of the South America 2 clade》。

学术背景
犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus, CDV）是一种高度传染性的病原体，可导致犬类出现严重的呼吸道、胃肠道和神经系统症状。尽管疫苗接种已广泛使用，但全球范围内仍报告了接种疫苗后动物感染CDV的案例。CDV属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）的麻疹病毒属（Morbillivirus），其基因组为单股负链RNA（约15.7 kb），编码6种主要蛋白：核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大聚合酶蛋白（L）。其中，F和H糖蛋白是病毒颗粒的最外层蛋白，能够诱导中和抗体和保护性抗体，并决定病毒感染的宿主特异性。H蛋白是麻疹病毒属中变异最大的蛋白，不同CDV毒株间的差异超过10%，因此H基因测序常用于区分野毒株和疫苗株。

在南美洲，已检测到三种共循环的CDV谱系：South America 1/Europe 1（SA1/EU1）、South America 2（SA2）和South America 3（SA3）。SA2谱系主要存在于阿根廷的犬群中。本研究旨在分离并鉴定一株来自阿根廷的SA2谱系野毒株（ARG24），并对其全基因组进行测序，以进一步比较野毒株与疫苗株的抗原性和免疫学特性。

研究流程
1. 病毒分离与培养
- 研究对象：从一只接种过重组CDV疫苗（Recombitek C6, Merial®）但出现临床症状的4月龄犬采集的外周血单核细胞（PBMC）。
- 细胞系：使用B95A、Vero和Vero SLAM（表达犬信号淋巴细胞激活分子，Signaling Lymphocyte Activation Molecule）细胞系进行病毒分离。Vero SLAM细胞对CDV感染高度敏感，成功分离到野毒株ARG24。
- 病毒扩增：通过连续传代培养ARG24毒株，测定其滴度（1.1 × 10^5 TCID50/mL），并观察细胞病变效应（CPE），包括合胞体形成和多核巨细胞出现。

1. 全基因组测序

   • RNA提取与反转录：使用Quick-RNA™ Miniprep Kit提取病毒RNA，通过Maxima H Minus双链cDNA合成试剂盒制备cDNA。
     
   • 高通量测序：采用Illumina MiniSeq平台进行测序，使用DNASTAR-NG软件比对和组装基因组序列（参考序列：CDV strain 5804 P, AY386316）。
     
   • 基因组分析：ARG24基因组全长15,650 nt，包含6个基因（N、P、M、F、H、L）。与疫苗株Onderstepoort相比，核苷酸相似性为92.2%，氨基酸相似性在N、P、M、F、H和L蛋白中分别为97.1%、90.3%、96.7%、90.6%、89.8%和97.3%。
     

2. H基因特征分析

   • 糖基化位点：ARG24的H蛋白有8个潜在N-连接糖基化位点，其中4个与Onderstepoort疫苗株共享（aa 19–22、149–151、422–424、587–589），另4个为野毒株特有（aa 309–311、391–393、456–458、603–605）。
     
   • 半胱氨酸残基：ARG24的H蛋白含12个半胱氨酸残基，但ARG30毒株在440位点新增一个半胱氨酸残基。
     

3. 系统发育分析

   • 基于全基因组序列的最大似然树显示，ARG24与SA2谱系的其他野毒株聚类，且与疫苗株遗传距离较远。H基因分析进一步证实ARG24属于SA2谱系，与阿根廷其他野毒株（ARG30、ARG39、ARG40）的核苷酸相似性为98.4–100%。
     

主要结果
1. 成功分离并鉴定了ARG24毒株，其在Vero SLAM细胞中表现出高效的复制能力和明显的CPE。
2. 全基因组测序揭示了ARG24与疫苗株的显著差异，尤其是H和F基因的高变异性。
3. H蛋白的糖基化位点和半胱氨酸残基变异可能影响病毒的抗原性和免疫逃逸能力。
4. 系统发育分析证实ARG24属于SA2谱系，为阿根廷特有的CDV野毒株。

结论与意义
本研究首次报道了阿根廷SA2谱系CDV野毒株的细胞培养分离和全基因组测序。ARG24毒株的可用性为比较野毒株与疫苗株的抗原性和免疫学特性提供了重要工具，有助于研究疫苗失败的原因和开发新型疫苗。此外，H蛋白的遗传变异分析为CDV的分子流行病学和进化研究提供了新见解。

研究亮点
1. 首次从阿根廷犬群中分离到SA2谱系的CDV野毒株，并完成全基因组测序。
2. 揭示了ARG24毒株与疫苗株在H蛋白糖基化位点和半胱氨酸残基上的关键差异。
3. 证实Vero SLAM细胞系是分离和培养CDV野毒株的高效工具。
4. 为CDV的疫苗研发和分子流行病学研究提供了重要数据支持。

其他有价值内容
研究发现，ARG24毒株来自一只接种过疫苗的犬，提示疫苗保护可能存在局限性。未来研究可进一步探索野毒株与疫苗株的抗原性差异，以及H蛋白变异对病毒宿主适应性和免疫逃逸的影响。