罗氏沼虾重要病原体DIV1的易感细胞模型构建及其基因组与致病性研究
一、 作者、机构与发表信息
本研究的主要作者为陈静、袁雪梅、黄磊、彭先启、郑阿琴、焦金彪和姚家云*。研究工作主要由浙江省淡水水产研究所（浙江省淡水渔业环境监测站）下属的农业农村部健康养殖重点实验室、浙江省鱼类健康与营养重点实验室以及湖州市渔业环境与水产品质量安全重点实验室完成。通讯作者为姚家云。该研究以“Construction of a susceptible cell model for decapod iridescent virus 1 (DIV1) infection”为题，发表于《Journal of Invertebrate Pathology》期刊，该文章目前为期刊预校样版本，接收日期为2026年5月8日。
二、 研究背景与目的
本研究聚焦于水产养殖动物病毒学与疾病防控领域，具体针对一种对全球甲壳类养殖业构成严重威胁的新兴病原体——十足目虹彩病毒1型（Decapod iridescent virus 1， DIV1）。DIV1感染范围广，可感染罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）、凡纳滨对虾、脊尾白虾、中华绒螯蟹等多种重要经济甲壳动物，且致死率高，造成重大经济损失。然而，长期以来，由于缺乏稳定、易感的细胞系，严重阻碍了针对DIV1病毒感染机制、病毒-宿主互作以及抗病毒策略的深入研究。现有研究多依赖甲壳动物原代细胞（如肝胰腺或造血组织细胞），但这些细胞存在寿命短、无法连续传代、标准化困难等固有缺陷。
基于此研究瓶颈，本研究设定了三个核心目标：第一，利用一种昆虫来源的细胞系，通过系统优化感染参数，建立一个功能性的DIV1体外感染模型。第二，利用高通量测序技术，对一株新获得的DIV1毒株进行全基因组测序，解析其基因组特征并确定其系统发育地位。第三，通过人工感染实验，验证细胞培养的DIV1病毒在相关甲壳动物宿主中的致病性，从而将体外模型与体内病理结果相关联。本研究旨在通过整合基因组学、细胞生物学和体内实验方法，为DIV1研究提供一个亟需的实验平台，支持未来针对性疾病管理策略的开发。
三、 详细研究流程
本研究包含多个相互关联的实验流程，具体如下：
1. 病毒分离与细胞培养： 研究首先从自然感染DIV1的患病罗氏沼虾肝胰腺组织中分离病毒。约100毫克组织经匀浆、低速离心去除碎片后，上清液通过0.22微米滤膜过滤除菌，获得无菌病毒悬液。通过绝对定量实时荧光定量PCR（qPCR）测定病毒载量为1.04 × 10^8 拷贝/纳克DNA。病毒原液分装后于-80°C保存备用。用于建立感染模型的细胞系为白纹伊蚊（Aedes albopictus）细胞系Aa01，使用添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的MEM培养基，在28°C、5% CO2条件下培养。
2. 体外感染模型建立与优化： 此流程旨在验证Aa01细胞对DIV1的易感性并确定最佳感染条件。当细胞汇合度达到约80%时，用十倍系列稀释的DIV1病毒液感染细胞。为确定病毒与细胞相互作用的最佳孵育时间，研究人员设置了2、4、6、8、10和12小时共六个孵育时间点。在每个时间点后，移除病毒接种液，更换为完全培养基，继续在28°C培养，每日观察细胞病变效应（Cytopathic effect， CPE）。当CPE达到约80%时，收集细胞并测定病毒载量，以评估病毒复制动力学。此外，为了定量评估细胞培养病毒的感染性滴度，研究采用了组织培养感染剂量（TCID50）测定法。将病毒悬液进行十倍系列稀释（10^-1至10^-9），每个稀释度接种8个重复孔于铺满Aa01细胞的96孔板中，培养后观察CPE，并使用Reed-Muench法计算TCID50。
3. 人工感染挑战实验： 此流程旨在验证细胞培养的DIV1病毒是否保留其体内致病性。将感染DIV1的细胞培养上清液过滤后，用无菌PBS制备成原液、10倍、100倍和1000倍稀释液。健康的罗氏沼虾随机分为五组：四个实验组（分别注射上述四种稀释度的病毒液）和一个对照组（注射无菌PBS）。每尾虾肌肉注射0.1毫升相应液体。连续观察7天，记录死亡率，并对死亡虾进行DIV1检测以确认死因。
4. 组织病理学与透射电镜分析： 为了在组织水平和超微结构水平确认DIV1感染引起的病理变化，研究对人工感染实验中死亡或濒死的罗氏沼虾肝胰腺组织进行了分析。对于组织病理学，样品经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片后进行苏木精-伊红（H&E）染色，在光学显微镜下观察。对于透射电镜（TEM）分析，样品使用含戊二醛和多聚甲醛的固定液固定，随后经锇酸后固定、Spurr树脂包埋、超薄切片、醋酸铀和柠檬酸铅染色，最后在透射电子显微镜下观察，以寻找细胞内的病毒粒子。
5. 全基因组测序与生物信息学分析： 从病毒感染的细胞中提取基因组DNA。使用Illumina HiSeq X平台进行双末端测序，插入片段大小为350 bp。对原始测序数据进行质量评估和过滤，获得高质量清洁数据。使用PGAP v5.0软件对组装结果进行基因预测。使用BWA将短读段比对回基因组以评估组装质量。使用Diamond将预测的蛋白编码基因比对到非冗余蛋白（NR）和通用蛋白（UniProt）数据库进行功能注释。使用Blast2GO进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路注释。
6. 系统发育分析： 为了确定本研究分离的DIV1毒株在虹彩病毒科（Iridoviridae）中的分类地位，从NCBI数据库检索了涵盖虹彩病毒科下多个属（包括蛙病毒属、肿大细胞病毒属、淋巴囊肿病毒属、十足目虹彩病毒属、绿虹彩病毒属、虹彩病毒属）的34个代表性虹彩病毒的氨基酸序列。将这些序列与本研究获得的DIV1基因组推导的氨基酸序列一起，使用RAxML软件，在GTRGAMMA模型下进行最大似然法（Maximum Likelihood， ML）系统发育树构建，并进行1000次自举重复以评估分支支持度。
四、 主要研究结果
1. 细胞易感性确认与感染条件优化结果： 研究成功证实了Aa01细胞对DIV1易感。未感染的对照组细胞在整个培养期间保持典型的半贴壁圆形、高折光性形态。而DIV1感染的细胞则表现出明显的细胞病变效应，包括细胞形态变得不规则，部分细胞呈梭形或长条形，随后细胞逐渐从培养表面脱落并聚集成漂浮的细胞团块。这直接证明了DIV1可以在该昆虫细胞系中复制并引起细胞损伤。在确定最佳孵育时间的实验中，病毒载量检测结果显示，在感染后0至6小时内，细胞内的病毒载量呈逐渐上升趋势，并在6小时达到峰值；6至12小时间病毒载量趋于稳定。这表明在本实验条件下，6小时是病毒-细胞相互作用的最佳孵育时间，为后续标准化感染实验提供了关键参数。
2. 病毒滴度定量与致病性验证结果： TCID50测定结果显示，在Aa01细胞中繁殖的DIV1病毒滴度为10^-2.67 TCID50/0.1毫升。这一数据量化了细胞培养病毒的感染性，为后续使用确定感染复数（MOI）进行实验提供了基础。人工感染挑战实验的结果更具说服力：注射未稀释和10倍稀释病毒液的实验组，在感染后7天累计死亡率均达到100%，其中未稀释组在3天时就开始出现死亡。注射100倍和1000倍稀释病毒液的实验组，累计死亡率分别为72%和38%，而PBS对照组全部存活。所有死亡虾经检测均呈DIV1阳性。这些结果清晰地证明了细胞培养的DIV1病毒保留了高度的致病性，并且其致病力呈现剂量依赖性，建立了体外培养病毒与体内疾病模型的直接关联。
3. 病理学与超微结构观察结果： 组织病理学检查揭示了DIV1感染导致的显著肝脏胰腺损伤。健康虾的肝胰腺小管排列紧密、有序，横截面呈椭圆形。而感染虾的肝胰腺结构严重紊乱，小管呈环形排列且排列松散。透射电镜分析提供了病毒复制的超微结构证据，在感染组织的细胞质中观察到了病毒粒子。这些发现从组织和细胞层面确认了DIV1在罗氏沼虾体内的活跃增殖，并揭示了其主要的靶器官病理变化，使整个致病过程的研究链条更加完整。
4. 基因组特征与系统发育分析结果： 通过对感染细胞提取的病毒DNA进行测序和组装，获得了DIV1毒株的完整基因组。该基因组为双链DNA，全长165，567 bp，GC含量为34.58%，共预测到176个开放阅读框（ORFs）。测序平均深度达24，097×，覆盖均匀，保证了组装序列的完整性。该基因组序列已提交至GenBank，登录号为PX754577。系统发育分析基于34个代表性虹彩病毒的氨基酸序列构建的最大似然树显示，本研究的DIV1毒株与十足目虹彩病毒属的其他病毒株（如SHIV， CQIV）紧密聚为一支，共同构成一个独立进化支。该属与虹彩病毒属和绿虹彩病毒属亲缘关系最近，与肿大细胞病毒属亲缘关系最远。高自举值支持了该拓扑结构的可靠性，从而在分子水平确认了该毒株的分类学地位属于十足目虹彩病毒属。
五、 研究结论与意义
本研究成功构建了一个基于白纹伊蚊Aa01细胞系的、可复制的DIV1体外感染模型。该模型支持DIV1的完整复制周期，能产生特征性CPE，并可量化病毒滴度（10^-2.67 TCID50/0.1 ml）。研究确定了6小时为最佳病毒-细胞孵育时间，为后续研究提供了标准化感染方案。同时，本研究完成了一株致病性DIV1分离株的全基因组测序与表征，明确了其在十足目虹彩病毒属内的系统发育位置。至关重要的是，通过体内挑战实验证实，细胞培养的病毒保留了高度的、剂量依赖性的致病力，能在罗氏沼虾中引起严重的肝胰腺组织病理损伤和符合自然感染的死亡模式，并在感染组织中观察到病毒粒子。
该细胞模型有效克服了甲壳动物原代细胞培养的诸多限制（如寿命短、无法传代、标准化难），为DIV1的基础病毒学研究（如病毒入侵、复制动力学、宿主互作）和应用性筛选（如抗病毒药物、疫苗候选物评估）提供了一个标准化、可扩展、可重复的实验平台。尽管昆虫细胞模型可能无法完全模拟甲壳动物特异的免疫反应等所有方面，但其作为一个强大且实用的补充工具，为深入研究这种严重威胁全球甲壳类养殖业的病原体打开了突破口。本研究整合基因组学、细胞模型和体内验证的研究范式，也为研究其他甲壳动物病毒病原体提供了可借鉴的路径。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
本研究在讨论部分还深入比较了昆虫细胞模型与原代甲壳动物细胞培养的优劣。作者指出，虽然原代细胞能提供宿主特异性视角，但其可用性、寿命和标准化程度存在局限。相比之下，Aa01细胞系提供了一个可再生的、可扩展的、重复性好的实验系统，特别适用于高通量抗病毒筛选、病毒蛋白功能研究等初级甲壳动物细胞难以胜任的应用。同时，作者也客观指出了该模型的局限性，即作为昆虫细胞系，可能无法完全捕捉甲壳动物特异的免疫反应、受体-配体互作或组织嗜性的所有方面，因此应被视为一个强大的补充工具而非最终宿主特异性系统的完全替代品。这种审慎的评估体现了研究的科学严谨性。此外，研究获得了浙江省重点研发项目等多个基金的资助，显示了该研究受到的应用导向关注。