本研究由广东药科大学王淑美教授团队与广州中医药大学陈云波教授团队等合作完成。主要作者包括Dan Tang、Wen-jiao He（共同第一作者）、Yun-bo Chen（通讯作者）和Shu-mei Wang（通讯作者）。论文发表于Phytomedicine期刊2022年第95卷，于2021年9月27日在线发表。

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是糖尿病最严重的并发症之一，也是全球终末期肾病的主要原因。黄连解毒汤（Huang-Lian-Jie-Du Decoction, HLJDD）是中医经典方剂，由黄连、黄柏、黄芩和栀子按3:2:2:3比例组成，具有清热解毒功效，临床上广泛用于糖尿病治疗。然而，HLJDD对DN的肾脏保护作用及其潜在机制尚未完全阐明。为此，本研究旨在利用db/db小鼠模型探讨HLJDD对DN的潜在治疗作用，并阐明其作用机制。

本研究采用了网络药理学、药效学、分子生物学和代谢组学的整合策略。首先，研究者利用网络药理学方法，以HLJDD在大鼠血浆中吸收的成分为基础，预测HLJDD治疗DN的可能通路。网络药理学分析共鉴定出31个HLJDD吸收成分，通过构建化合物-靶点-疾病网络，获得100个HLJDD抗DN的潜在靶点。蛋白-蛋白相互作用网络分析显示，PIK3R1、PIK3CA、STAT3、EGFR、AKT1、MAPK1、MAPK3等靶点具有较高的度值，提示这些靶点可能在DN治疗中发挥重要作用。KEGG通路富集分析表明，糖尿病并发症中的AGEs/RAGE信号通路是最显著富集的通路，14/98个主要节点集中于该通路，提示AGEs/RAGE通路可能是HLJDD治疗DN的关键通路。

在体内实验中，研究者选用雌性C57BL/KSJ-db/db小鼠作为DN模型，以同龄C57BL/KSJ-db+/+m小鼠为对照。经过45天适应期后，db/db小鼠被随机分为模型组（Mod）、低剂量HLJDD组（HDL，2 g/kg/d）、高剂量HLJDD组（HDH，8 g/kg/d）和二甲双胍组（Met，0.25 g/kg/d），每组10只，连续给药12周。

药效学结果显示，HLJDD能显著改善db/db小鼠的糖脂代谢紊乱。与对照小鼠相比，db/db小鼠的体重、血糖、果糖胺、总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平均显著升高；HLJDD治疗4周后体重明显下降，血糖和果糖胺水平显著降低，甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平也明显改善。在肾功能方面，db/db小鼠的尿尿素氮、尿肌酐和尿白蛋白排泄率均显著增加；HLJDD治疗后这些指标恢复至接近对照水平。肾脏组织病理学检查（HE、Masson和PAS染色）显示，db/db小鼠出现明显的肾小球系膜基质扩张、基底膜增厚、糖原沉积和胶原纤维增加；HLJDD治疗显著改善了这些病理改变。免疫组化分析显示，db/db小鼠肾脏中纤维化相关蛋白TGF-β1表达显著升高，而足细胞标志物nephrin表达显著降低；HLJDD给药后，TGF-β1水平明显下降，nephrin表达明显恢复。

在机制研究中，HLJDD对AGEs/RAGE通路表现出显著的抑制作用。ELISA检测显示，db/db小鼠血浆和肾脏组织中AGEs水平显著升高，HLJDD治疗后AGEs积累明显减少。免疫荧光和Western blot分析表明，db/db小鼠肾脏中乙二醛酶1（GLO1，一种能降解AGEs前体甲基乙二醛的关键酶）蛋白表达降低，而RAGE蛋白表达升高；HLJDD给药后，GLO1表达显著增加，RAGE表达显著降低，特别是在高剂量组。

此外，HLJDD激活了Akt/Nrf2抗氧化通路。db/db小鼠肾脏中SOD活性和GSH水平显著降低，MDA水平显著升高，提示存在氧化应激损伤；HLJDD治疗后SOD和GSH水平明显升高。Western blot分析显示，db/db小鼠Akt磷酸化水平降低，HLJDD治疗显著上调Akt磷酸化水平。免疫荧光染色显示，db/db小鼠肾小球中Nrf2核转位减少，HLJDD治疗增强了Nrf2的核转位。Nrf2下游抗氧化因子HO-1和SOD2的表达也被HLJDD上调。

在代谢组学研究中，研究者对小鼠尿液样本进行了UPLC-Q-Orbitrap HRMS/MS分析。PCA和OPLS-DA分析显示对照组、模型组和HLJDD组之间存在明显的代谢聚类。通过OPLS-DA分析和筛选，共鉴定出22个潜在生物标志物，其中17个在HLJDD治疗后恢复至接近对照水平。这些标志物主要涉及苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、葡萄糖代谢和鞘脂代谢四条代谢通路。相关性分析显示，糖脂指标、肾功能指标和羰基应激指标与大多数潜在生物标志物呈正相关，而抗氧化因子与大多数标志物呈负相关。特别是硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚与糖脂和肾功能指标呈强正相关。

本研究的主要结论是：网络药理学分析表明AGEs/RAGE通路是HLJDD抗DN最显著的通路；体内实验证实HLJDD通过调节AGEs/RAGE/Akt/Nrf2通路和代谢谱改善db/db小鼠的糖脂代谢紊乱和肾脏损伤。该研究首次揭示了HLJDD通过抑制AGEs/RAGE通路并激活Akt/Nrf2抗氧化通路来保护DN的机制。

本研究的科学价值在于：采用网络药理学、药效学、分子生物学和代谢组学的多学科整合策略，系统阐明了HLJDD抗DN的作用机制。其应用价值在于：为HLJDD临床治疗DN提供了科学依据，也为中药复方治疗DN的机制研究提供了新的思路。研究亮点包括：首次证实HLJDD通过调控AGEs/RAGE/Akt/Nrf2通路保护DN；发现了22个尿液中与DN相关的潜在生物标志物；采用多组学整合方法揭示中药复方的多靶点、多通路作用机制。

此外，研究还发现db/db小鼠尿液中硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚等重要尿毒症毒素水平显著升高，HLJDD干预后明显降低，提示HLJDD可能通过调节肠道菌群相关代谢途径发挥肾脏保护作用。这一发现为深入研究HLJDD的作用机制提供了新的方向。