关于离子强度和糖类对单克隆抗体聚集倾向影响的研究学术报告
本报告旨在详细介绍日本大阪大学与第一三共株式会社研究人员于2013年发表在《Pharmaceutical Research》期刊上的一项原创性研究。该研究题为“Effects of Ionic Strength and Sugars on the Aggregation Propensity of Monoclonal Antibodies: Influence of Colloidal and Conformational Stabilities”，由Saito Shuntaro、Hasegawa Jun、Kobayashi Naoki、Tomitsuka Toshiaki、Uchiyama Susumu和Fukui Kiichi合作完成。此项工作系统地探讨了影响治疗性单克隆抗体（mAbs）稳定性的关键物理化学因素，并提出了一套优化抗体药物制剂配方的普适性策略。
一、研究背景与目的 治疗性蛋白质药物，尤其是单克隆抗体，在其生产、储存和运输的生命周期中易发生聚集。蛋白质聚集不仅可能导致药物失活，更可能引发不良的免疫原性反应，因此是生物制药领域亟待解决的关键问题。蛋白质聚集的途径复杂，主要与其两种稳定性密切相关：胶体稳定性（Colloidal Stability）和构象稳定性（Conformational Stability）。胶体稳定性反映了分子在溶液中的分散程度，由分子间吸引力和排斥力（如静电相互作用、范德华力）的平衡决定；而构象稳定性则反映了蛋白质维持其天然折叠结构的能力，通常用折叠态与去折叠态之间的自由能差（ΔGfu）来衡量。理解这两种稳定性如何受配方条件（如pH、离子强度、辅料）影响，并建立它们与不同压力条件下（如高温储存、冻融循环）聚集倾向的定量关系，对于理性、高效地开发稳定制剂至关重要。
此前的研究虽然分别探讨过这些因素，但缺乏一个统一、系统的框架来指导配方优化。特别是，盐离子和糖类这两种常用辅料对胶体稳定性和构象稳定性的具体影响机制及其如何协同作用于不同压力条件下的聚集，尚不完全清晰。因此，本研究旨在填补这一空白。研究的具体目标包括：1）评估不同离子强度（通过添加NaCl实现）对四种代表性单克隆抗体胶体稳定性的影响，并探究其与静电相互作用的关联；2）研究糖类（山梨醇、蔗糖、海藻糖）对胶体稳定性和构象稳定性的影响；3）建立胶体稳定性参数（第二维里系数B2）和构象稳定性参数（解链温度Tmax）与在40°C加速稳定性条件下及冻融循环压力下聚集倾向之间的定量关系；4）基于静电势表面模拟，从分子层面解释观察到的现象，并最终提出一套分步、通用的单克隆抗体制剂配方优化策略。
二、详细研究流程 本研究采用了多学科交叉的实验手段与理论模拟相结合的方法，工作流程严谨且系统。
研究对象与样品制备： 研究选用了四种人源化IgG1单克隆抗体，分别命名为Mab-A、Mab-B、Mab-C和Mab-D。它们具有相同的恒定区序列，但互补决定区（CDR）的氨基酸序列不同，导致其理论等电点（pI）在6.7至9.0之间分布。所有抗体均经高度纯化，并预先针对不同的初始缓冲液（pH 5.0醋酸钠缓冲液，pH 6.0, 7.0, 8.0磷酸钠缓冲液）进行透析，以确保起始离子强度最低。随后，以此为基础，制备包含不同浓度NaCl（+70, +140, +300 mM）或不同糖类（5%山梨醇、10%蔗糖、10%海藻糖）的配方溶液。所有稳定性实验均在10 mg/mL的抗体浓度下进行。
实验流程与分析方法： 1. 胶体稳定性评估： 这是本研究的核心部分，通过多种互补技术进行。 * 沉降平衡分析超速离心（AUC-SE）： 这是测量第二维里系数（B2）的关键方法。将抗体样品在1、5、10 mg/mL三个浓度下，于20°C和40°C以11,000 rpm的转速进行离心，达到沉降平衡后，通过Rayleigh干涉光学系统监测浓度梯度。通过分析表观分子量（Mw,app）随初始装载浓度的变化，根据公式 1/Mw,app = 1/Mw + 2B2C 计算得到B2值。正的B2值表示分子间存在净排斥作用，负值则表示净吸引作用。此方法被作者强调能特异性地反映分子间相互作用。 * 动态光散射（DLS）： 用于测量扩散相互作用参数（kd）。测量抗体在2至10 mg/mL浓度范围内的扩散系数，通过公式 Dm = Ds (1 + kd C) 计算kd。kd与B2具有理论关联，可用于相互验证。同时，DLS也用于测量无限稀释下的自扩散系数（Ds），该参数是计算净电荷所必需的，并用于监测样品中是否形成亚微米颗粒。 * 电泳光散射： 使用Mobius仪器测量抗体的电泳迁移率，进而计算其Zeta电位和净电荷（Z）。净电荷基于Debye-Hückel-Henry模型，结合测得的电泳迁移率和Ds计算得出，它反映了蛋白质在实际溶液环境中的全局静电属性。
构象稳定性评估： 采用差示扫描量热法（DSC）。将1 mg/mL的抗体溶液从20°C加热至100°C，扫描速率为60°C/小时，记录热容（Cp）变化。以缓冲液作为空白对照进行基线扣除后，确定最高吸热峰对应的表观解链温度（Tmax），主要代表抗体Fab片段的构象稳定性。
聚集倾向性测试： 在不同压力条件下评估实际聚集情况。
静电势表面模拟： 为了从结构上理解观察到的静电相互作用，研究使用Discovery Studio软件，以已知的IgG1晶体结构（PDB: 1HZH）为模板，构建了Mab-A和Mab-B的全长模型。随后，通过求解泊松-玻尔兹曼方程，在不同pH和离子强度下计算了抗体表面的静电势。将+1 kBT/e（正电势）和-1 kBT/e（负电势）的等值面分别映射为蓝色和红色区域，从而可视化静电势的分布情况。
三、主要研究结果 研究结果揭示了盐和糖对单克隆抗体稳定性复杂而清晰的调控机制。
1. 离子强度对胶体稳定性（B2）的影响呈现“双刃剑”效应： 结果明确显示，盐（NaCl）对胶体稳定性的影响取决于分子间相互作用的初始性质。对于在低离子强度下B2为负值（净吸引）的抗体（如Mab-A在pH 5和7，Mab-B在pH 7），增加NaCl浓度会使B2值增大（即排斥增强或吸引减弱），甚至由负转正。这表明盐屏蔽了导致分子间相互吸引的静电偶极相互作用，从而提高了胶体稳定性。相反，对于在低离子强度下B2为很大正值（强排斥）的抗体（如Mab-B、Mab-C、Mab-D在pH 5），增加NaCl浓度会急剧降低B2值。这表明盐屏蔽了分子间有益的静电排斥力，从而降低了胶体稳定性。这种截然相反的影响通过静电势表面模拟得到了完美解释：Mab-A在低离子强度下表现出电势分布不均（正负电势区域相邻），易于产生偶极吸引；而Mab-B在低离子强度下则呈现均匀的大面积正电势区域，产生强排斥。高离子强度下，两者的大电势区域均消失，变为稀疏的小电势斑块，相互作用减弱。
2. 胶体稳定性（B2）与40°C储存聚集倾向高度相关： 在40°C储存条件下（此时抗体保持折叠状态），四种抗体在不同NaCl配方中的聚集速率与在20°C测得的B2值呈现显著的线性负相关。B2值越高（排斥越强），聚集速率越低。数据表明，当B2 > 40 × 10^−5 (mL·mol)/g²时，聚集几乎被完全抑制。这一关键发现意味着，在主要由热运动驱动的聚集路径中，胶体稳定性（由静电相互作用主导）是主要的决定因素，并且可以通过在配方开发早期测量B2来准确预测。
3. 糖类主要提升构象稳定性，对胶体稳定性影响有限： 实验表明，添加山梨醇、蔗糖或海藻糖对B2值没有显著改变，即不直接影响胶体稳定性。然而，DSC结果显示，所有糖类都能提高抗体的Tmax值，表明它们通过“优先水合”机制显著增强了抗体的构象稳定性。在40°C稳定性测试中，虽然聚集速率与B2的相关性仍然是主要趋势，但在含糖配方中，聚集速率略低于仅由B2预测的数值，这部分“额外”的稳定作用就归因于构象稳定性的提升。
4. 冻融聚集受构象稳定性主导，机制更为复杂： 在冻融循环压力下，聚集行为与B2的关联性不如40°C储存条件下明确。例如，Mab-A在pH 5下，即使在高吸引（负B2）的配方中，冻融聚集也较低；而Mab-B在pH 7下，无盐（负B2）配方的冻融聚集反而比有盐配方更低。这表明冻融过程引入了胶体稳定性模型无法完全涵盖的复杂应力，如冷变性、冰-水界面吸附、低温浓缩导致的局部pH和离子强度剧烈变化等。然而，一个清晰的规律是：在所有测试的配方中添加糖类，都显著改善了抗体抵抗冻融聚集的能力。这强有力地证明了，在冻融这类涉及界面和低温变性的压力下，增强构象稳定性是防止聚集的更有效手段。
5. 净电荷与胶体稳定性的关系具有局限性： 研究发现，净电荷（Z）并不能始终可靠地预测胶体稳定性（B2）。例如，Mab-A在pH 5时净电荷为正，但B2为负（吸引）。这是因为净电荷是一个全局标量，而分子间的静电相互作用取决于表面电势的空间分布。不均匀的电荷分布（如相邻的正负电势区）即使净电荷不为零，也能产生强烈的局部吸引。这凸显了静电势表面模拟在理解分子间相互作用方面比简单净电荷更具价值。
四、结论与研究价值 本研究得出了一套系统、理性的单克隆抗体制剂配方优化策略，包含三个明确步骤： 第一步：基于胶体稳定性优化pH和盐。 首先在目标pH范围内（通常为酸性至中性）测量抗体在最低离子强度下的B2值。选择能产生最大B2值的pH。若在此pH下B2为正（排斥），则应避免添加盐，以免屏蔽有益的静电排斥。若B2为负（吸引），则可以添加盐来屏蔽静电吸引，从而提高稳定性。 第二步：基于构象稳定性选择合适的糖类。 在第一步确定的配方基础上，添加不同糖类并通过DSC测量Tmax。选择能提供最高Tmax的糖，以最大程度地提升构象稳定性，这对改善冻融稳定性尤为重要。 第三步：对筛选出的候选配方进行直接的稳定性测试验证。 在此框架内，可进一步微调盐和糖的浓度以满足渗透压等制剂要求。
本研究的科学价值在于，首次清晰地区分并定量关联了胶体稳定性和构象稳定性在应对不同压力（热应力 vs. 冻融应力）时对单克隆抗体聚集的相对贡献，并揭示了盐离子“屏蔽”作用的双重性本质。其应用价值极高，为工业界提供了一个减少试错、节省时间和物料的高效制剂开发流程。通过早期引入AUC-SE、DSC和静电势模拟等分析工具，可以在进行耗时漫长的长期稳定性试验之前，就理性地预测和优化配方的稳定性表现。
五、研究亮点 1. 系统性： 研究将胶体稳定性（B2, kd, 净电荷）、构象稳定性（Tmax）、实际聚集测试（SEC, DLS, 浊度）和理论模拟（静电势表面）有机结合，构建了一个完整的评估框架。 2. 机制洞察深刻： 通过静电势表面模拟，从分子结构层面直观解释了为何盐对不同的抗体会产生稳定或失稳的相反效果，将宏观现象与微观静电分布联系起来。 3. 策略普适性强： 提出的三步优化策略基于物理化学原理，不受限于特定抗体，适用于具有不同表面电势特性的单克隆抗体（如本研究中的Mab-A和Mab-B两种典型类型）。 4. 数据驱动与预测性： 建立了B2与40°C聚集速率的定量相关性，使胶体稳定性参数成为一个有效的早期预测指标，提升了制剂开发的科学性和效率。 5. 对复杂压力（冻融）的清晰解读： 明确了在冻融条件下，构象稳定性的提升（通过添加糖）是控制聚集的关键因素，为应对这一制剂常见挑战提供了明确指导。