本研究由Mei-Hong Chen（哈尔滨工业大学国际持久性有毒物质联合研究中心、黑龙江省极地环境与生态重点实验室）、Sheng-Hu Zhang（中华人民共和国生态环境部南京环境科学研究所）、Shi-Ming Jia（哈尔滨工业大学）、Li-Jun Wang（哈尔滨医科大学）和Wan-Li Ma（通讯作者，哈尔滨工业大学）合作完成，发表于2022年《Chemosphere》第288卷（在线发表日期为2021年10月7日），论文标题为《小鼠肝微粒体体外生物转化磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯和磷酸三苯酯的动力学及关键CYP亚型研究》。
学术背景
随着多溴联苯醚（PBDEs）的逐步淘汰，有机磷阻燃剂（OPFRs）作为替代品在全球广泛应用。然而，OPFRs在环境、生物及人体样本中频繁检出，其潜在的肝毒性机制和代谢途径尚不明确。本研究聚焦两类典型OPFRs：含氯有机磷阻燃剂（Cl-OPFR）代表磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯（TDCIPP）和芳基有机磷阻燃剂（Aryl-OPFR）代表磷酸三苯酯（TPHP），旨在通过小鼠肝微粒体体外实验揭示其代谢动力学特征及关键代谢酶CYP450亚型，为评估OPFRs的肝毒性机制和解毒过程提供理论依据。
研究流程
样本制备与处理
- 实验动物：使用60只6周龄SPF级ICR雄性小鼠，通过颈椎脱位法处死后取肝脏组织，经预冷生理盐水冲洗后液氮速冻。
- 肝微粒体制备：采用差速离心法（9000g、105000g离心）分离微粒体，蛋白浓度测定采用Bradford法（20.89 ± 0.83 mg/mL）。
体外代谢实验
- 反应体系：含0.42 mg/mL微粒体蛋白、0.2 μM OPFRs（TDCIPP或TPHP）、0.6 mM NADPH及Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），37℃振荡孵育（120 rpm）。
- 代谢动力学：设置7个浓度梯度（0.1–1.0 μM），TDCPP和TPHP分别孵育120分钟和30分钟，通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）定量分析底物消耗。
关键CYP450亚型鉴定
- 抑制剂实验：选用6种CYP亚型特异性抑制剂（如CYP1A2抑制剂α-萘黄酮、CYP2E1抑制剂双硫仑等），在0–50 μM浓度下孵育4小时，评估其对代谢率的影响。
数据分析
- 动力学模型：采用米氏方程（Michaelis-Menten）拟合代谢速率，计算Vmax和Km值。
- 统计学方法：使用GraphPad Prism 8.0进行单因素方差分析（ANOVA），显著性阈值设为p < 0.05。
主要结果
代谢速率差异
- TPHP代谢速率显著高于TDCIPP（120分钟代谢率：91.6% vs. 60.6%），半衰期分别为0.1531小时和1.8083小时，表明TPHP更易被肝微粒体代谢。
- 动力学参数：TDCIPP的Km值（1.800）高于TPHP（1.760），提示TPHP与CYP450酶的结合亲和力更强。
关键代谢酶鉴定
- TDCIPP：CYP2E1、CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19是其主要代谢酶，其中CYP2E1和CYP2D6的抑制使代谢率降低80%和63%（p < 0.01）。
- TPHP：仅CYP2E1显著影响其代谢（抑制后代谢率下降53%，p < 0.001）。
代谢路径分析
- TDCIPP的慢代谢特性与其含氯结构的环境稳定性相关，而TPHP的快速代谢可能归因于芳基结构的易氧化性。
结论与价值
本研究首次系统比较了TDCIPP与TPHP在小鼠肝微粒体中的代谢差异，明确了CYP2E1是两者共同的关键代谢酶，但TDCIPP依赖更复杂的CYP亚型组合。这一发现为OPFRs的肝毒性机制提供了新视角：
- 科学价值：揭示了OPFRs代谢的酶学基础，填补了Cl-OPFR与Aryl-OPFR代谢动力学数据的空白。
- 应用价值：为评估OPFRs的生物蓄积性和人体健康风险提供了体外模型参考，尤其对制定阻燃剂替代策略具有指导意义。
研究亮点
- 方法创新：结合抑制剂筛选与动力学模型，精准定位关键CYP亚型。
- 发现新颖性：首次报道CYP2D6在TDCIPP代谢中的主导作用，挑战了传统认为CYP3A4为主要代谢酶的观点。
- 跨学科意义：将环境化学与毒理学结合，为持久性有机污染物的代谢研究提供了范式。
其他价值
研究还提示，TDCIPP的慢代谢特性可能导致其在生物体内长期蓄积，而TPHP的快速代谢可能生成更具活性的羟基化产物，需进一步评估其毒性转化机制。