本研究由Aiming Gu（嘉兴学院附属医院神经内科）、Zhihao Wu、Peng Wang、Jun Liu、Jianfeng Wang（嘉兴学院附属嘉兴市妇幼保健院小儿外科）、Qianqian Wang和Jie Chen*（上海交通大学医学院附属新华医院小儿外科、上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心小儿外科）共同完成，于2023年1月9日发表在《Frontiers in Pediatrics》期刊（DOI: 10.3389/fped.2022.975799），聚焦先天性巨结肠（Hirschsprung disease, HSCR）结肠动力障碍的机制研究。

学术背景

HSCR是一种以远端肠道先天性神经节细胞缺失为特征的消化道动力障碍性疾病，发病率约1/5000，临床表现为顽固性便秘和肠梗阻。尽管根治性拖出术是主要治疗手段，但术后仍常见结肠动力障碍并发症。既往研究认为，肠道动力调控依赖于肠神经系统（ENS）与平滑肌细胞（SMCs）、Cajal间质细胞（Interstitial Cells of Cajal, ICCs）及血小板衍生生长因子受体α阳性（PDGFRα+）细胞形成的”SIP功能合胞体”协同作用。然而，HSCR患者不同结肠区段（狭窄段、扩张段及近端正常段）中ICCs/ANO1通道与PDGFRα+/SK3通道的分布差异及其对动力障碍的影响尚未明确。本研究旨在通过分子生物学与电生理学实验，揭示上述细胞及离子通道的表达变化与结肠动力异常的关联。

研究流程

1. 样本收集与分组

纳入16例短段型HSCR患儿手术切除的结肠标本（排除长段型及合并其他畸形者），临床资料见表1。将结肠分为三组：狭窄段（无神经节细胞）、扩张段（继发性扩张）及近端正常段（含正常神经节细胞，作为对照）。所有样本经HE染色验证神经节细胞分布后，立即置于0°C Krebs液中转运至实验室。

2. 分子生物学分析

• 蛋白质表达检测：采用Western blot分析三组结肠平滑肌中c-Kit（ICC标志物）、ANO1（钙激活氯通道）、PDGFRα及SK3通道的蛋白水平。使用ImageJ量化条带灰度值，以GAPDH为内参。
  
• mRNA表达检测：通过qRT-PCR测定上述基因的mRNA表达量，引物序列见表2。采用ΔCt法相对定量，以GAPDH为内参。
  

3. 电生理学实验

• 肌条制备：沿结肠环肌轴切取8.0×2.0×2.0 mm肌条，悬挂于37°C氧合Krebs液的器官浴槽中，连接张力传感器（RM6240C系统）。
  
• 自发收缩记录：平衡1小时后，记录各组肌条自发收缩的频率与振幅。
  
• 电场刺激（EFS）：参数为50 V、0.5 ms脉宽、20 s持续时间，观察6/9/12 Hz刺激下的收缩-舒张反应。
  
• 药物干预：依次加入以下抑制剂/激动剂：
  
  • TTX（神经元阻滞剂）：验证神经依赖性调控
    
  • NPPB（ANO1通道抑制剂）：评估ICCs功能
    
  • L-NAME（一氧化氮合酶抑制剂）：检测NO通路作用
    
  • Apamin（SK3通道抑制剂）与CyPPA（SK3激动剂）：分析PDGFRα+细胞功能
    

4. 数据分析

采用SPSS 20.0进行配对t检验与ANOVA分析，数据以均值±标准差表示，p<0.05为显著。

主要结果

1. 分子表达差异：

   • 狭窄段的c-Kit/ANO1（ICC标志物）及PDGFRα/SK3（PDGFRα+细胞标志物）的mRNA和蛋白表达均显著低于扩张段与近端段（p<0.05，图1-2）。Western blot显示c-Kit（110-115 kDa）、ANO1（114-120 kDa）、PDGFRα（188-192 kDa）及SK3（80-90 kDa）条带灰度值在狭窄段降低50%以上。
     

2. 电生理特性：

   • 自发收缩：狭窄段肌条的收缩频率与振幅显著高于近端段（p<0.05，图3a），且TTX干预后近端段张力升高，狭窄段无变化（图3b），提示狭窄段动力调控不依赖神经输入。
     
   • EFS反应：近端段表现为先舒张后收缩的双相反应，而狭窄段舒张消失且收缩增强（图4），反映抑制性神经递质（如NO）释放缺陷。
     
   • 药物干预：
     
     • NPPB抑制ANO1后，近端段收缩抑制率显著高于狭窄段（p<0.05，图5a），证实ICCs功能受损。
       
     • L-NAME阻断NO合成后，近端段张力升高而狭窄段无响应（图5b），支持NO-ICCs轴功能缺失。
       
     • Apamin（SK3抑制剂）增强三组收缩，但近端段反应更敏感（图5c）；CyPPA（SK3激动剂）则显著抑制近端段收缩（图5d），表明PDGFRα+细胞功能从近端向狭窄段逐渐衰退。
       

结论与意义

本研究首次系统揭示了HSCR结肠不同区段中ICCs/ANO1与PDGFRα+/SK3的表达梯度下降规律，并提出”SIP合胞体”功能失衡是术后动力障碍的关键机制：
1. 科学价值：阐明ENS-ICCs-SMCs与ENS-PDGFRα+-SMCs两条调控轴在HSCR结肠中的空间异质性，为肠道动力调控理论补充了新证据。
2. 临床意义：狭窄段ICCs与PDGFRα+细胞的严重缺失导致抑制性信号（如NO）无法传递，提示未来可通过靶向ANO1/SK3通道改善术后动力障碍。

研究亮点

1. 创新发现：首次证实PDGFRα+/SK3通道在HSCR结肠中的表达缺陷与动力障碍直接相关，突破了既往仅关注ICCs的局限。
   
2. 方法学优势：结合qRT-PCR、Western blot与多药物干预的电生理实验，全面解析分子表达与功能表型的关联。
   
3. 转化潜力：为开发针对ANO1/SK3的靶向药物（如CyPPA类似物）提供了实验基础。
   

其他价值

研究获上海市卫生健康委员会（201940508）、浙江省卫健委（2022KY390/2022RC271）等基金支持，所有数据已公开于文章附件，实验方案经上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会批准（XHEC-D-2018-1052）。作者声明无利益冲突。