这是一项由Yale University多个系所的研究人员合作完成的原始研究。主要作者包括Tanja Hann、Arya B. Ökten、Renata B. Filler、Craig B. Wilen和Anna Marie Pyle，其中Craig B. Wilen和Anna Marie Pyle为通讯作者。该研究发表于Cell期刊，于2026年10月29日在线发表。
该研究属于RNA病毒学与RNA结构生物学交叉领域。诺如病毒（norovirus）是导致全球胃肠炎疾病的主要病原体之一，但目前尚无获批的疫苗或特异性抗病毒治疗手段。长期以来，人类诺如病毒（human norovirus, hnv）的研究受限于缺乏可扩展的细胞培养体系、反向遗传学工具和小动物模型。鼠诺如病毒（murine norovirus, mnv）作为hnv的可操作模型系统，能够部分再现hnv的基因组结构、蛋白表达和复制策略。虽然RNA病毒基因组中的二级结构已被越来越多地认为是病毒功能的重要调控元件，但对它们在真实感染条件下、在体内的系统性鉴定及其对病毒适应性和免疫识别的影响仍了解有限。因此，本研究旨在通过感染细胞内的全基因组化学探测，系统性绘制mnv的RNA二级结构图谱，并通过遗传学手段和动物感染模型，解析这些RNA结构元件在病毒生命周期中的调控功能，最终探索基于RNA结构定向破坏来设计减毒活疫苗的可行性。
研究的工作流程主要分为四个阶段。第一阶段是在感染细胞内进行全基因组RNA结构探测。研究人员使用mnv CW3株感染BV2小鼠小胶质细胞系，随后分别用SHAPE-Map和FBDMS-Map两种正交的化学探测技术处理细胞。SHAPE试剂2A3主要报告RNA骨架的柔性，而DMS在FBDMS-Map条件下可探测全部四种碱基，反映碱基配对状态。每种技术均设置了两次独立生物学重复。利用ShapeMapper软件分析突变率，并以SHAPE数据作为实验约束条件，使用SuperFold软件预测全长7.4 kb的mnv二级结构模型。通过比较化学修饰样品与未处理对照的突变率，确认了化学修饰成功。将SHAPE和DMS反应性映射到预测的单链和双链区域时，双链区域的反应性显著更低，表明两种化学探测数据集与预测结构模型间具有良好的一致性。同时，研究团队定义了“低SHAPE-低Shannon”（lowSS）指标来识别稳定且结构确定的RNA元件，要求至少40个核苷酸的SHAPE反应性和Shannon熵值均低于全局中位数，且在两个SHAPE-Map重复数据中均出现。
第二阶段利用进化分析验证RNA结构的功能保守性。研究者基于mnv序列比对计算同义突变率（dS）和非同义突变率（dn），并将dS值映射到结构模型中的单链和双链区域。比较发现双链区域的dS显著低于单链区域，而dn在两类区域间无显著差异，这提示RNA结构含量在进化中受到约束。研究者进一步将分析扩展到涵盖九个诺如病毒基因群（GI–GIX）的更广泛比对，并专门分析了人类诺如病毒GII型的序列比对，发现mnv和hnv GII在基因组末端、RDRP-VP1边界以及VP1基因内部均存在相似的dS抑制区域。对于单个lowSS元件，lowSS1、lowSS5、lowSS7和lowSS16的双链区域dS也显著低于其单链区域。
第三阶段利用反义锁核酸（locked nucleic acid, LNA）进行功能筛选。研究者设计了针对16个静态结构区域中多个结构的LNA/DNA混合体寡核苷酸，长度约19–22个核苷酸，两端各有三个连续LNA碱基以增强双链稳定性，中间不超过三个连续DNA碱基以避免RNase H激活和细胞毒性。同时设置了靶向近旁单链区域的阴性对照LNA、全局乱序对照LNA，以及靶向已知5′端和3′端结构的阳性对照LNA。将LNA转染至感染细胞后，通过细胞活力实验和空斑实验评估其对病毒复制的影响。结果显示，靶向大多数候选结构的LNA均能提高感染后24小时的细胞存活率并降低病毒滴度，其中靶向lowSS1和lowSS13的LNA效果最强，但靶向lowSS10的LNA未表现出生长抑制。
第四阶段通过反向遗传学构建结构解链突变病毒，并在细胞和动物模型中验证功能。研究人员在mnv CW3基因组中引入同义密码子突变，特异性地破坏lowSS1、lowSS5、lowSS6、lowSS10和lowSS13等元件的碱基配对，同时构建了针对核心亚基因组启动子和3′端茎环的对照突变。将野生型和突变质粒转染HEK293T细胞后收获P0病毒，通过空斑实验测定回收滴度，并对扩增后的病毒进行Illumina二代测序以检测回复突变或二次突变。核心亚基因组启动子突变体回复为野生型并获得了多个额外突变，因此被排除出后续研究。lowSS10突变体在P0代即显示约2个对数级的滴度下降。生长动力学实验显示，lowSS1突变体在早期时间点滴度降低达1个对数级，lowSS10突变体在24和48小时降低近2个对数级。为区分RNA结构破坏与重叠的VF1蛋白氨基酸改变的影响，研究者在野生型和lowSS10突变体中分别敲除VF1开放阅读框（ORF4），结果表明野生型VF1敲除与野生型表型一致，lowSS10 VF1敲除与lowSS10突变体表型一致，证明表型来自RNA结构破坏。补偿性突变实验恢复了碱基配对但保持序列改变，结果病毒滴度接近野生型水平，进一步确证表型源于结构丢失而非序列特异效应。为检测翻译调控功能，研究者构建了基于Gaussia荧光素酶的翻译报告系统，将lowSS1或lowSS10元件插入荧光素酶ORF的5′区域，以体外转录的加帽RNA转染感染和未感染的BV2细胞。结果显示，破坏lowSS1结构显著降低荧光素酶输出，而破坏lowSS10结构显著提高荧光素酶输出，表明lowSS1为翻译增强元件，lowSS10为翻译抑制元件。
在体内实验中，研究者用结构解链突变病毒感染C57BL/6小鼠，4天后采集肠系膜淋巴结、回肠、结肠和脾脏，通过绝对RT-qPCR定量病毒基因组拷贝数。在肠系膜淋巴结中，所有结构解链突变体的病毒RNA水平均显著低于野生型，lowSS10突变体降低近2个对数级，lowSS1降低约1个对数级。在回肠中，lowSS10突变体RNA大部分检测不到，lowSS1和lowSS5突变体降低约1个对数级。在免疫缺陷的IFNAR基因敲除小鼠中，感染lowSS10突变体的小鼠未出现体重下降，10只中9只存活至实验终点，而野生型CW3感染小鼠出现严重体重下降和死亡。lowSS10 VF1敲除病毒同样表现出减毒表型，证实减毒来自RNA结构破坏。
进一步的免疫保护实验中，C57BL/6小鼠先用模拟、野生型CW3或lowSS10突变体进行初次感染，2周后用野生型CW3攻击。初次感染后2周，野生型和lowSS10组小鼠均产生强烈的抗mnv血清IgG应答。攻击后，初次感染lowSS10突变体的小鼠在肠系膜淋巴结中仅检出极低水平的病毒RNA，在其他组织中检测不到病毒RNA，表现出完全保护。为评估遗传稳定性，研究者将lowSS10突变体及所有其他结构解链突变病毒在BV2细胞中连续传代8次，并在每次传代后对突变区域进行测序。结果显示在所有传代中均未检测到向毒力相关序列的回复突变。
本研究的主要结论是：mnv基因组在感染细胞内折叠成高度结构化的网络，约57%的核苷酸参与碱基配对，显著高于随机RNA序列的约30%。基因组中包含16个低SHAPE-低Shannon的静态结构区域，其中最大的位于5′端和3′端，多数集中在基因组的后半部分。这些结构元件的双链区域受到显著的进化约束，且mnv与hnv GII在基因组末端、RDRP-VP1边界和VP1基因内部共享相似的进化约束区域。lowSS1和lowSS10分别作为翻译增强子和翻译抑制子在顺式调控病毒基因组RNA和亚基因组RNA的翻译。破坏特定的RNA结构元件可在细胞培养中减弱病毒复制，在小鼠体内降低病毒RNA水平并减轻毒力。通过同义突变破坏lowSS10结构获得的减毒病毒能够在小鼠体内诱导保护性免疫，且在连续传代中保持遗传稳定。这些结果确立了RNA结构引导的减毒活疫苗设计框架，为RNA病毒疫苗和抗病毒治疗策略的开发提供了理性化路径。
该研究的亮点包括：首次在感染细胞中对全长mnv基因组进行系统性RNA二级结构分析，结合两种正交化学探测方法获得高置信度的结构模型；通过进化分析揭示RNA结构含量是诺如病毒基因组架构的保守特征；利用LNA和结构解链突变体的互补方法鉴定功能性RNA元件；发现lowSS1和lowSS10在编码序列内分别调控基因组和亚基因组RNA翻译，揭示了“编码中的编码”这一RNA调控层；成功构建了遗传稳定的结构减毒病毒，并在体内验证了其免疫原性和保护效力。研究的局限性在于mnv系统中的发现是否能够推广到hnv尚不确定，翻译报告系统使用加帽RNA而非病毒天然的VPg连接RNA，可能不能完全反映真实感染中VPg依赖性翻译起始的调控强度。