科学研究报告

研究作者及机构

本文的主要研究作者包括Kristy Koselny、Julianne Green、Louis Didone、Justin P. Halterman等，隶属于University of Rochester、University of Texas Health Science Center at San Antonio、University of Cincinnati College of Medicine、The Ohio State University等多家机构。本研究发表于《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》（2016年12月，卷60，第12期）。

研究背景

本研究属于抗真菌药物开发领域。近年来，侵袭性真菌感染（Invasive Fungal Infections, IFIs）的治疗是现代医学的一大挑战，尤其是在免疫力低下人群中，这些感染具有极高的死亡率（20%-100%），而现有的抗真菌药物种类有限，创新速度缓慢。过去30年，仅一种新的抗真菌药物类别进入临床应用，新药开发的难点主要在于真菌和人类之间在许多生物学过程上的高度保守性，使得开发选择性杀灭病原体而对宿主无害的分子成为巨大挑战。此外，当前治疗HIV/AIDS患者中常见的如隐球菌性脑膜炎（Cryptococcal Meningitis）等重要病原感染，仍然依赖于已有50年历史的药物如Amphotericin B和5-Flucytosine。

本次研究聚焦于一种新型小分子AR-12，这是一种基于抗癌药物Celecoxib衍生的化合物，已在I期抗癌研究中测试。本研究旨在系统评估AR-12在抗真菌治疗中的在体外活性、作用机理及在动物模型中的治疗效果。

研究流程及方法

1. 体外抗真菌活性实验：

   • 研究对象包括常见病原性酵母（如Candida albicans）、非Albicans念珠菌（Non-albicans Candida spp.）、隐球菌（Cryptococcus neoformans）以及致病霉菌和二相真菌（Dimorphic Fungi），共含43个临床分离菌株。
   • 使用了标准的CLSI M27-A3和M38-A2方法对药物的最低抑菌浓度（MIC）进行评估。

2. 体内抗真菌疗效评价：

   • 在小鼠模型中评估AR-12对隐球菌影响，实验使用A/J小鼠，设立4组（空白对照、Fluconazole单用、AR-12单用以及两药联用），观察不同治疗组对脑部真菌负荷（CFU）的影响。

3. 药物作用机制研究：

   • 探讨AR-12是否通过抑制酵母乙酰辅酶A合成酶（Acetyl Coenzyme A Synthetase, ACS）发挥抗真菌作用。
   • 使用定量RT-PCR分析多药外排泵（Efflux Pumps）的表达。
   • 借助显微技术评估AR-12对线粒体功能及脂质代谢的影响。

4. 抗药性发展及突变体分析：

   • 使用菌株（Saccharomyces cerevisiae by4741）在逐步增加的AR-12浓度中连续传代，分离抗AR-12突变株，并通过全基因组测序鉴定潜在的突变。

5. 抗真菌联合用药研究和Checkerboard Assay分析：

   • 分析AR-12与已有抗真菌药氟康唑（Fluconazole）及Caspofungin的协同作用，计算FICI（Fractional Inhibitory Concentration Index），研究药物对抗药菌株的增敏作用。

主要研究结果

1. 体外抗真菌广谱活性：

   • AR-12对包括念珠菌、隐球菌、霉菌及二相真菌表现出广谱活性，MIC值为2-4 μg/mL，且在多株抗氟康唑及棘白菌素的耐药菌株中显示活性。
   • 特别值得注意的是，AR-12对Fusarium和Scedosporium等难治性感染显示效果优于现有一线药物。

2. 药物机制：

   • AR-12通过抑制真菌乙酰辅酶A合成酶搅乱细胞代谢；影响线粒体质子泵的活性，从而降低菌株ATP水平。
   • AR-12不会显著影响外排泵基因的表达，但可通过降低脂质合成负荷增强氟康唑的抗真菌能力。

3. 协同效应：

   • Checkerboard Assay显示，AR-12与氟康唑和Caspofungin在多个抗药株上具有协同效应，其中AR-12显著下调药物所需的抑制浓度。

4. 抗药性探索：

   • 单次突变难以造成对AR-12的高水平抗药性，但包含外排泵调控基因（如PDR1）变异的多重突变可能发展为中高水平的抗药性。

5. 动物实验：

   • 在鼠源隐球菌感染模型中，单独使用AR-12无显著效果，但与氟康唑联合使用，可较仅使用氟康唑降低约1对数值的脑部真菌负荷。

研究结论及意义

本研究首次证明AR-12能够以一种全新的机制对广泛的病原真菌表现出抑菌活性，并能够与现有药物协同增强治疗效果。AR-12的抗真菌机制独特，通过阻断乙酰辅酶A的合成，影响真菌代谢，从而表明乙酰辅酶A合成酶可能是未来抗真菌治疗中潜在的重要靶点。同时，AR-12在广谱活性及初步药代动力学特性方面显示出成为下一代抗真菌候选药物的潜力。

研究亮点

1. AR-12表现出对除酵母外还涵盖霉菌及二相真菌的广谱活性。
2. 发现乙酰辅酶A合成酶作为新型抗真菌靶点的潜力，具有理论及开发价值。
3. 在动物模型中证明了其与氟康唑的显著联合效果，为抗真菌联合治疗提供新方案。

展望与进一步开发

尽管AR-12在本研究中表现出显著的抗真菌活性，但其单独应用在部分动物模型中的作用仍受限于浓度和药代动力学参数。未来可通过优化化学结构以及配合同类疾病的临床模型进行进一步研究，并初步验证其在改善抗真菌治疗领域的临床价值。

参考文献

Koselny K, Green J, Didone L, Halterman JP, Fothergill AW, Wiederhold NP, Patterson TF, Cushion MT, Rappelye C, Wellington M, Krysan DJ. 2016. The celecoxib derivative AR-12 has broad-spectrum antifungal activity in vitro and improves the activity of fluconazole in a murine model of cryptococcosis. Antimicrob Agents Chemother 60:7115–7127. doi:10.1128/AAC.01061-16.