基于核酸链接免疫夹心法在阿尔茨海默病及神经退行性疾病中的生物标志物发现研究学术报告
本研究由来自多个国家的顶尖研究机构共同完成。主要作者包括Nicholas J. Ashton、Andrea L. Benedet、Guglielmo Di Molfetta等。通讯作者为Nicholas Ashton，其所属机构包括Banner Sun Health研究所、瑞典哥德堡大学萨尔格伦斯卡学院精神病学与神经化学系等。该研究发表于《Alzheimer’s & Dementia》期刊，接收日期为2024年12月9日，被分配了DOI号10.1002/alz.14621，预计于2025年正式刊出（卷期：2025;21:e14621）。该研究发表遵循知识共享许可协议，为开放获取文章。
一、 研究学术背景 该研究属于神经病学，特别是神经退行性疾病生物标志物发现的领域。随着免疫学方法的进步，对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）病理相关生物标志物的精确定量已成为可能。血浆p-tau217和Aβ42/40等标志物的发现显著推动了血液诊断的发展。然而，目前仍面临诸多挑战：首先，p-tau217等标志物尚不足以完全解释AD病程中的tau累积程度、临床进展纵向变化或对淀粉样蛋白清除疗法的反应。其次，AD仅占所有痴呆病例的约60%，针对路易体病、TDP-43蛋白病等其它神经退行性蛋白病的特异性血液生物标志物仍然匮乏，例如α-突触核蛋白种子扩增试验从脑脊液向血液的转化尚未实现，NfL等标志物则疾病特异性有限。此外，在治疗决策中，迫切需要能够预测干预反应或不良事件风险的预后性生物标志物谱。 传统的生物标志物发现方法，如液相色谱串联质谱法，常因高丰度蛋白信号掩盖低丰度蛋白信号，导致血浆蛋白质组覆盖度有限，难以检测到皮摩尔以下水平的蛋白。因此，需要高多重性、高灵敏度（如阿托摩尔级）的技术平台。本研究旨在探索一种结合了已知高性能生物标志物检测与新型生物标志物发现能力的新策略。 本研究的具体目标是利用新型的高通量蛋白质组学技术——核酸链接免疫夹心法，在AD及其它神经退行性蛋白病（路易体病、颗粒蛋白前体基因突变相关额颞叶痴呆）的患者中，对血浆、血清和脑脊液样本进行系统性生物标志物筛选与评估，以期发现新的、可能具有疾病特异性或与疾病进程相关的蛋白质变化，并验证该技术平台在整合已知标志物与发现新标志物方面的潜力。
二、 详细研究流程 本研究包含四个独立的队列分析，总参与者数为190名。工作流程主要分为参与者招募与样本采集、NULISA技术平台分析、数据处理与统计分析三大步骤。 1. 参与者与样本：研究设计了四个具有不同疾病内表型的队列。 * 队列1：从伦敦大学学院痴呆研究中心的“阿尔茨海默病协会全球生物标志物标准化联盟血浆磷酸化tau轮状研究”中招募40名参与者。根据脑脊液Aβ42/40和p-tau181（Lumipulse G检测）浓度进行生物学分类（AD vs. 非AD）。采集血浆、血清和脑脊液样本。 * 队列2：从西班牙巴塞罗那Hospital del Mar的Biodegmar纵向观察性研究中选取40名轻度认知障碍患者。根据脑脊液Aβ42/p-tau比值分为AD病理阳性（MCI+）和阴性（MCI-）。采集血浆样本。 * 队列3：在意大利布雷西亚招募54名参与者。通过脑脊液α-突触核蛋白种子扩增试验确定有无路易体病理（LB+ vs. LB-）。LB-组为AD患者（CSF p-tau/Aβ42比值>0.9），LB+组包括路易体痴呆和帕金森病患者（AD生物标志物阴性）。采集血浆样本。 * 队列4：在意大利布雷西亚大学神经退行性疾病中心招募40名参与者，包括颗粒蛋白前体基因突变携带者（有症状FTD患者及无症状携带者）和无突变的健康对照。采集血浆样本。 所有研究均遵循赫尔辛基宣言，并获得当地伦理委员会批准，参与者均签署书面知情同意书。 2. NULISA技术分析：本研究采用了由Alamar Biosciences公司开发的核酸链接免疫夹心法（NulISA）技术。这是一种新型的高灵敏度、高多重性的蛋白质检测平台。 * 原理与流程：样本（血浆、血清、CSF）解冻离心后，取上清进行检测。针对神经系统疾病，研究使用了NULISA CNS疾病面板。该技术利用带有DNA条形码的捕获抗体和检测抗体与目标蛋白形成免疫复合物。随后，复合物被磁性寡聚-dT磁珠捕获并清洗。接着，复合物在低盐缓冲液中释放，并被链霉亲和素磁珠捕获和再次清洗。最后，免疫复合物上DNA链的近端末端被连接，生成一个同时包含靶标特异性和样本特异性条形码的DNA报告分子。所有样本的报告分子汇集后，通过聚合酶链式反应扩增，纯化，并在Illumina NextSeq 2000上进行测序。定量结果以NULISA蛋白定量单位表示。 * 单重验证：除了多重面板，研究还使用Alamar公司的单重NULISA p-tau217检测试剂盒在ARGO原型仪器上对队列1样本进行了独立验证，以评估其与现有高性能p-tau217检测方法的一致性。 3. 数据处理与统计： * 数据标准化：对于NULISA测序数据，首先通过内部对照计数进行板内归一化，然后使用板间对照进行板间归一化。数据经重新缩放、加1后取log2转换，得到NPQ单位用于后续分析。 * 统计分析：使用R软件进行。组间人口学变量比较使用卡方检验或方差分析。使用Limma模型进行组间差异蛋白表达分析（如AD vs. 非AD、MCI+ vs. MCI-、LB+ vs. AD、GRN+ vs. GRN-）。结果通过火山图展示，并进行了错误发现率校正。使用Spearman秩相关检验评估不同体液基质（血浆vs血清、血浆vs CSF、血清vs CSF）之间蛋白质水平的相关性。使用受试者工作特征曲线下面积评估生物标志物区分不同组别的诊断准确性。所有统计均考虑了多重比较。
三、 主要研究结果 1. NULISA在生物学定义的AD中的表现（队列1）： * 血浆：与non-AD相比，AD患者血浆中有6个蛋白发生差异表达。其中4个上调蛋白通过多重检验校正：p-tau217、GFAP、p-tau231和BACE1。p-tau217的logFC最高（1.68），表明其是最显著的改变。 * 血清：观察到18个显著改变的蛋白。其中p-tau217和GFAP通过了多重检验校正，与血浆结果一致，但显著蛋白数量更多。 * 脑脊液：观察到22个显著改变的蛋白，其中14个上调，1个下调的蛋白通过了校正。脑脊液中显著改变的蛋白谱与血液有所不同，反映了不同体液基质的信息差异。 * 技术验证：NULISA多重检测测得的血浆p-tau217水平与Janssen、Alzpath、Lumipulse以及质谱法等现有高性能单重p-tau217检测方法结果高度相关（r值在0.924-0.936之间），且诊断准确性相似。NULISA单重与多重p-tau217检测结果也强相关（r=0.906）。 2. NULISA在MCI患者中的发现（队列2）： * 在AD病理阳性的MCI（MCI+）与阴性（MCI-）患者的血浆比较中，共发现17个差异蛋白。 * 已知标志物：只有p-tau217通过了多重检验校正，其变化倍数最高（logFC=1.49）。GFAP和p-tau231也显著上调，但未通过FDR校正。 * 新发现：多个与炎症和免疫相关的细胞因子（如IL-6, TNF, CRP）显著下调。淀粉样蛋白肽Aβ38和Aβ42也下调。值得注意的是，一些与突触核蛋白病相关的蛋白（如PARK7/DJ-1，FABP3）也出现下调。尽管未达到统计显著性，寡聚化α-突触核蛋白（Oligo-SNCA）显示出比p-tau217更大的变化倍数（logFC=-1.54），提示了潜在研究价值。 3. NULISA在路易体病理与AD对比中的发现（队列3）： * 在LB+（α-syn SAA阳性，Aβ阴性）与AD（α-syn SAA阴性，Aβ阳性）患者的血浆比较中，发现了15个差异蛋白。 * 关键差异：4个蛋白通过多重检验校正：Aβ42（在LB+中上调）和血管内皮生长因子受体FLT1（上调）；p-tau217（下调）和神经元特异性烯醇化酶（ENO2，下调）。这突显了Aβ42和p-tau217在区分这两种病理中的互补作用。 * α-syn相关蛋白：虽然Oligo-SNCA的变化未达到统计显著性，但其变化倍数与p-tau217相当（logFC=-1.05），为未来在更大样本中探索血浆α-syn标志物提供了线索。 4. NULISA在颗粒蛋白前体基因突变携带者中的发现（队列4）： * 这是变化最显著的队列。在GRN突变携带者与非携带者的血浆比较中，共发现65个上调的差异蛋白，其中55个通过了多重检验校正。 * 最显著标志物：神经丝轻链（NfL）是变化最显著的蛋白（logFC=2.74），在遗传性FTD中作为神经退行性变的强力标志物。 * 重要新发现：神经颗粒蛋白、寡聚化α-突触核蛋白、超氧化物歧化酶1、Sequestosome 1以及TDP-43均显示出与NfL相当的高变化倍数（logFC在2.46-2.54之间）。特别是血浆TDP-43的显著上调，为开发FTD/TDP-43蛋白病的血液生物标志物带来了希望。 5. 体液基质间比较： * 血浆 vs. 血清：在队列1中，约30.9%的蛋白在血浆和血清间的相关性不显著。值得注意的是，p-tau181、p-tau231、Aβ38、Aβ42、t-tau、TDP-43等关键神经标志物在两个基质间的相关性很差或无显著相关。而NfL、p-tau217和GFAP在两个基质间则显示出显著且较强的相关性。这表明血浆和血清并非完全可互换的生物流体，在标志物发现和验证中需明确区分。 * 血液 vs. 脑脊液：在队列1中，约25.6%的血浆蛋白与CSF中对应蛋白水平显著相关，包括CRP、PDGFRβ、p-tau217和NfL。血清与CSF的相关性比例更低（16.7%），但关键蛋白如CRP、PDGFRβ和NfL仍显示出强相关性。
四、 研究结论与意义 本研究通过应用新型NULISA技术平台，证实了将已验证的高性能单一分析物（如p-tau217、NfL）整合入多重分析面板，同时进行新生物标志物发现的可行性和价值。 * 科学价值：研究证实了p-tau217在AD连续谱中的核心地位，并在GRN突变携带者中独立、无偏地验证了NfL作为最显著标志物。更重要的是，研究揭示了在AD、MCI、路易体病和GRN相关FTD等不同疾病内表型中，存在大量新颖的蛋白质组学变化，涉及突触处理、炎症、小胶质细胞反应性以及α-突触核蛋白和TDP-43病理相关蛋白。这极大地丰富了我们对这些疾病外周分子病理特征的理解。 * 应用价值：NULISA等高多重性、高灵敏度平台代表了临床蛋白质组学的新方向。它能够在一个低样本量的检测中，同时提供已验证的诊断标志物（用于疾病识别和分期）和探索性标志物（用于发现新病理机制和潜在治疗靶点）。这种“一体两面”的能力有望加速开发针对AD及其他神经退行性疾病的、基于血液的诊断和预后工具，满足当前未被满足的临床需求，特别是在疾病鉴别诊断和治疗反应监测方面。 * 重要观点：研究强调了血浆和血清作为生物标志物来源的互补性而非互换性，指出在标志物发现中需对基质进行明确区分和系统比较。
五、 研究亮点 1. 技术方法新颖：率先在神经退行性疾病生物标志物研究中应用了NULISA技术，展示了其高灵敏度、高多重性和整合已知/未知标志物的独特优势。 2. 研究设计系统性：采用了基于生物学定义（病理内表型）的多队列设计，涵盖了AD连续谱、路易体病和遗传性FTD，使得发现的结果具有明确的病理指向性。 3. 发现成果丰富且具启发性： * 在AD/MCI中，除确认核心tau标志物外，揭示了炎症标志物的下调模式。 * 在路易体病中，提示了血浆Oligo-SNCA作为潜在标志物的可能性。 * 在GRN突变携带者中，发现了大规模的血浆蛋白质组扰动，特别是NfL、神经颗粒蛋白和TDP-43的剧烈变化，为FTD生物标志物研究开辟了新途径。 * 系统比较了不同体液基质，为未来研究中的样本选择提供了关键数据。 4. 验证性与探索性结合：研究不仅通过关联分析验证了NULISA平台检测p-tau217等关键标志物的可靠性，更重要的是展现了其在无偏性发现新生物标志物方面的强大能力。
六、 其他有价值内容 研究明确指出了其局限性，主要为四个队列的样本量均较小，属于探索性试点研究。因此，所识别出的新标志物或未达到显著性但显示出变化的蛋白，需要在更大规模、更稳健的独立队列中进行验证。然而，研究中对p-tau217、GFAP和NfL等已知关键标志物的成功复现，增强了这些新发现的可靠性，并为后续大规模验证研究提供了明确的目标和方向。同时，研究得到了包括瑞典研究理事会、欧盟地平线计划、阿尔茨海默病药物发现基金会等多家机构的广泛资助，也反映了该领域研究的重要性和受关注程度。作者披露了部分作者与企业存在咨询、顾问或研究资助关系，符合学术规范。