本文由Hui Peng、Sergei Kotelnikov、Megan E. Egbert等人联合完成，并于2025年3月6日发表在国际学术期刊《Cell》中（DOI: 10.1016/j.cell.2025.01.003）。主要通讯联系人为来自University of Regina的Mohan Babu、来自Stony Brook University的Dima Kozakov以及来自OHSU的Andrew Emili。
蛋白质-小分子代谢物的相互作用（Protein-Metabolite Interactions, PMIs）在生化通路及细胞生理适应性调控中起重要作用。然而，尽管蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interactions, PPIs）绘图技术已取得长足进展，关于蛋白质-小分子相互作用的实验映射数据却远远落后。目前，即使对于研究最为透彻的模式细菌——大肠杆菌，在公共注释数据库（如KEGG和EcoCyc）中预测的PMIs，仅有极少部分获得实验验证。这一知识盲区不仅限制了我们对细菌生理的全面理解，同时影响多个领域的研究进展，包括生物医学、感染性疾病预防、代谢工程及合成生物学。
为填补上述知识盲区，该研究旨在构建一个高分辨率的、全面的内源性蛋白质与配体相互作用图谱，具体目标包括：(1) 精准鉴定与转录因子及必需酶结合的小分子代谢物；(2) 通过整合代谢途径、进化预测及生物物理学验证，探索这些相互作用的功能意义；(3) 构建化学探针设计的框架，从而为合成化学研发及生化实验提供依据。
研究团队开发了一个结合亲和纯化、精准质谱技术及高分辨率分子对接的新型工作流程，从模型细菌大肠杆菌中鉴定了296种化学多样性小分子代谢物，并绘制出它们与69种必需酶及45种转录因子的交互图谱。以下是主要步骤及技术亮点：
亲和纯化与质谱筛选 (LP/MS)： 通过利用大肠杆菌ASKA ORF克隆文库中N端6xHis标签蛋白菌株，研究者进行了快速磁珠亲和纯化。成功从597种大肠杆菌菌株的细胞裂解液中筛选出蛋白结合的小分子代谢物，并采用液相色谱-高分辨率Orbitrap质谱（LC/MS）进行定性鉴定。
严格筛选与验证： 质谱数据经过化学计量学及结构标准严格过滤，以排除非特异性配体。此外，通过独立实验验证及参考标准内标，确保候选配体的准确鉴定和再现性（平均重现性R² = 0.87）。
分子对接及结构验证： 在结构建模过程中，研究者应用“LigTBM”及“PocketDock”等算法，以之前的蛋白质配体相互作用数据库（如PDB、KEGG中的记录）为模板，对实验鉴定的配体与蛋白质结合位点进行结构对接建模。对最终候选PMIs进行结构评分及绑定位点的组氨酸等关键残基突变实验验证。
整合分析： 已鉴定的PMIs通过整合代谢通路数据库如KEGG、EcoCyc及实验生成的代谢图谱展开功能拓展研究，构建分子的网络层次及拓扑结构特征。
生物物理学与生理学验证： 采用表面等离子体共振（SPR）技术对特定多种PMIs进行结合力常数 (Kd) 的测定；同时在体外反应及活细胞（in vivo）条件下对部分蛋白-配体作用的功能表型进行验证，例如测试GapDH（糖酵解酶）对竞争性抑制剂的反应。
PMIs的谱系精细图构建： 在114种大肠杆菌蛋白质中，研究共鉴定了296种高置信度小分子相互作用。许多内源性配体通过生物物理学及高分辨分子对接验证，涵盖多种代谢瓶颈中反应底物及产物。同时，发现大部分PMIs的结合位点（如关键氨基酸残基）在微生物中高度保守。
功能性代理研究： 蛋白-配体交互网络显示广泛的结合特性，如GapDH对与ADP核糖（ADP-ribose）的诱导绑定，直接参与了细胞糖酵解路径中的调控。此外，发现转换酶（Folate生物合成中关键）存在代谢反馈绑定代谢中间产物。
动态基因调控发现： 某些转录因子（如YjdC）绑定重要代谢物配体（如油酸），可强力调节其目标基因转录的表达。此外，冷震蛋白（如CspA）及全局调节因子（如Fis）被发现直接绑定循环AMP（即细胞信号小分子），体现更复杂的转录调控。
合成化学探针的设计： 通过分析蛋白质-配体的结合位点，研究设计出基于天然配体（如antranilate）的合成探针并成功验证了对目标蛋白（如铁螯合酶HemH）的强抑制作用，为新型抗菌药物研发开创了新领域。
该研究首次系统性地构建了大肠杆菌蛋白质-内源性配体的全局交互图谱，为微生物代谢网络的调控研究奠定基础。不仅如此，研究中开发的高置信实验和计算策略，为探索其他微生物代谢系统的PMIs提供了普适性方法。此外，这些发现直接或间接推动了生物医学研究，包括靶向抗菌药物开发以及微生物组学的新型功能预测。
该研究不仅填补了基础科学数据空白，还开辟了未来微生物代谢及应用生物技术研究多领域的突破性机会。